Новые методы иммунодиагностики и критерии их оценки

СПИДа и некоторых других вирусных инфекций. Причем в этих случаях впервые

была показана возможность амплификации и для РНК-содержащих вирусов

(непосредственно, или через провирусную ДНК) [Реаkе I., 1989].

Одним из существенных достоинств генного зондирования с амплификацией

является возможность исследования субмикроскопического количества

патологического материала. Так уже показана возможность генетического

анализа материала единственной волосяной сумки, взятой из человеческой

кожи, или нескольких десятков буккальных клеток, полученных простым

полосканием полости рта [Lench N. еt аl., 1988].

Другой особенностью метода, более важной для анализа инфекционного

материала, является возможность выявления скрытых (молчащих) генов.

Например, выявление гена холерного токсина в штаммах без его

фенотипического проявления, позволяет сделать важные выводы при

эпидемиологическом анализе [Гинцбург А. Л., 1988].

Методы, связанные с использованием генного зондирования безусловно, будут

более широко внедряться в практику диагностики инфекционных заболеваний по

мере их упрощения и удешевления.

ИММуноэлектрофорез и ИММУНОБЛОТТИНГ

Иммуноэлектрофорез помогает идентифицировать антигены по

электрофоретической подвижности, особенно в том случае, когда в образце

присутствуют и другие антигены. С помощью данного метода в клинической

иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов и

идентифицируют миеломные белки.

На основе сочетания электрофореза с иммуноперципитацией разработано

несколько удачных

методов, в каждом из которых перемещение антигена в электрическом поле

приводит к его контакту с антителами. Встречный иммуноэлектрофорез может

применяться для определения антигенов, мигрирующих в агаре к положительно

заряженному электроду. Данный метод занимает меньше времени и более

чувствителен, чем двойная диффузия по Ухтерлони. Его применяют для

идентификации антигенов вируса гепатита В и соответствующих антител,

антител к ДНК при системной красной волчанке, аутоантител к растворимым

ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преципитинов) к

Aspergillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе. Ракетный

электрофорез-это количественный метод, предусматривающий внесение антигена

в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет форму ракеты , длина

которой определяется концентрацией антигена. Как и встречный электрофорез,

это-быстрый метод, но и здесь антиген должен перемещаться к положительно

заряженному электроду. Таким образом, ракетный электрофорез подходит для

белков, например альбумина, трансферрина и церулоплазмина, в то время как

концентрацию иммуноглобулинов обычно определяют методом простой радиальной

иммунодиффузии. Один из наиболее удачных вариантов ракетного электрофореза

- двухмерный или перекрестный иммуноэлектрофорез Лорелла. При этом на

первом этапе смесь антигенов электрофоретически разделяют в геле агарозы.

Затем разделенные белки вновь заставляют диффундировать в геле под влиянием

электрического поля в другом

[pic]

Рис. Виды иммуноэлектрофореза А- простой иммуноэлектрофорез; Б- встречный

иммуноэлектрофорез; В - ракетный иммуноэлектрофорез; Г - двумерный

иммуноэлектрофорез. Стрелки - направление движение АГ и АТ в электрическом

поле.

направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удалось количественно

определить каждый из антигенов смеси. Наиболее впечатляющий пример- это

оценка степени конверсии СЗ в инактивированную форму СЗс, которая часто

происходит при обострении в сыворотке больных системной красной волчанкой

или синовиальной жидкости пораженных суставов в острой фазе ревматоидного

артрита, а также в других случаях.

Иммуноблоттинг

После разделения сложной смеси белков методом электрофореза в

полиакриламидном или ага- розном геле их можно перенести из геля на

[pic]Рис. Схема иммуноблотинга

микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с

мембраной антигены могут быть идентифицированы с помощью меченых антител.

Данный метод получил широкое распространение. Например, он используется для

идентификации компонентов нейрофиламентов, которые предварительно разделяют

в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

[pic]

Рис. Пример иммуноблотинга

Разумеется, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методика

использоваться не может. Если белки антисывороткк разделить

изоэлектрофокусированием, а затем перенести (это и называется блоттингом)

на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так

называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител,

взаимодействующих с данным антигеном.

Схема: Основные методы окраски в иммуноблотинге (Western-blot).

КРИТЕРИИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Проблема дифференциации положительного и отрицательного результата не

является специфической для медицины, а пути ее разрешения лежат в области

математической статистики. Тем не менее, следует обсудить некоторые

практические вопросы, с которыми встречаются врачи при использовании

различных методов лабораторной диагностики, в том числе - иммунохимического

анализа при инфекционных заболеваниях.

Основным противоречием, возникающим при анализе лабораторных данных и

приводящим к совершенствованию известных и разработке новых методов

диагностики, является несоответствие между целью медицинской диагностики

как таковой, т. е. стремлением врача определить, чем болен пациент и целью

того или иного метода (установление какого-либо параметра внутренней среды

организма). Поэтому любой метод иммунохимического анализа должен

рассматриваться лишь как часть общей диагностической процедуры. Ни один из

этих методов не может быть использован вне клинической интерпретации.

Ложноположительные или ложноотрицательные выя реакции при лабораторном

анализе имеют значение не только для самого пациента. Такая ситуация при

СПИДе, например, оказалась опасной и в социальном и в эпидемиологическом

аспекте.

В лабораторном анализе при характеристике аналитической процедуры

принято указывать количественные показатели метода: чувствительность,

воспроизводимость, точность и др. Однако при определенных взаимодействиях

между организмом и инфекционным агентом может возникнуть ситуация, когда

высокочувствительный метод не позволяет получить достоверную информацию о

причине заболевания. Например, определение антител любыми совершенными

методами не дает информацию в случае выраженной иммуносупрессии

гуморального ответа.

Для того, чтобы выразить возможность использования симптома

(результата иммунохимического анализа) для диагностики определенного

заболевания можно определить понятия чувствительности и специфичности

анализа, в сравнении с контрольной группой здоровых людей, как частоту

положительных и отрицательных реакций.

число положительных реакций у больных с подтвержденным диагнозом

Чувствительность=-----------------------------------------------------------

----------

число обследованных больных с подтвержденным диагнозом

число отрицательных реакций в контрольной группе

Специфичность = ------------------------------------------------------------

-------------

число обследованных пациентов в контрольной группе

Эти параметры могут быть использованы при сравнении эффективности

каких-либо методов. Однако для применения их на практике необходимо

уточнить принципы формирования опытной и контрольной групп, а также

оценить, какое значение имеют вычисленные параметры для оценки случайно

выбранных неизвестных образцов. Правильное решение указанных вопросов и

позволяет перейти к разработке критериев положительной и отрицательной

реакции.

Для формирования опытной группы больных с инфекционной патологией, как

правило, используют больных, у которых обнаружен искомый инфекционный

агент другими методами - бактериологическими, вирусологическими и т. п. В

случае инфекции, вызываемой условнопатогенными микроорганизмами используют

количественные или функциональные критерии. В зависимости от целей анализа,

группа может быть более или менее однородной по другим признакам данного

заболевания - особенностям течения и тяжести инфекционного процесса,

возрасту больных, сопутствующему лечению (прежде всего - введению

антибиотиков).

Формирование контрольной группы из здоровых лиц является наиболее

частым, но не единственным способом. Если анализируемый метод будет

применен для дифференциального анализа _ сходных заболеваний, вызываемых

разными микроорганизмами, более важным является подбор группы с

заболеванием, которое следует исключить при установлении диагноза.

Например, при острой пневмонии, вызванной различными возбудителями (Str.

Pneumoniae, H. influenzae) для оценки чувствительности и специфичности,

например, метода определения антигенов пневмококка, следует сформировать

контрольную группу из больных с заболеванием, вызванным гемофильной

палочкой. Вышеуказанное важно учитывать при разработке методов диагностики.

Однако и при использовании этих методов следует иметь представление о

причинах возникновения и возможной интерпретации ложноположительных и

ложноотрицательных реакций. При анализе образцов от пациентов с

неизвестным диагнозом следует учитывать дополнительные параметры,

производные от чувствительности и специфичности анализа.

Ожидаемая ценность Число положительных результатов в опытной группе

положительного =-------------------------------------------------------

------------

результата Число положительных результатов в обеих группах

Ожидаемая ценность Число отрицательных результатов в опытной группе

отрицательного =--------------------------------------------------

-----------------

результата Число отрицательных результатов в обеих

группах

В целом, чем выше чувствительность и специфичность анализа, тем выше

ценность положительного и отрицательного результатов. Однако для случайно

взятых образцов значение ожидаемой ценности результатов будет зависеть от

частоты данного заболевания в популяции (преваленс). Например, при

чувствительности и специфичности метода равных 99% и частоте заболевания

0,1% количество больных на 100 000 пациентов составит 100, из них

положительная реакция будет у 99. Однако у пациентов без данного

заболевания (всего их 99 900) будет в 100 случаях также выявлена

положительная реакция. Таким образом, ценность положительного результата

составит 99/(100+99) 50%, а отрицательного - 99 80ОД99 800+1) 100%. В

случае же, если в данной популяции частота заболевания более высока, то и

ценность положительного результата выше. Например, при частоте в 10%,

соответствующие значения ценности положительного результата - 91,70/0, а

отрицательного - 99,9%.

Влияет ли выбор критерия оценки положительного и отрицательного

результата на чувствительность и специфичность анализа?

При оценке того или иного метода диагностики врач, как правило,

пользуется критериями, специально выработанными для данного метода, реже -

собственным опытом. В качестве критерия установления положительного или

отрицательного результата может выступать параметр в виде концентрации

вещества (в сравнении с концентрацией в норме). Могут быть использованы

безразмерные величины, выражающие отношение определяемого показателя к

нормальной величине. Иногда критерием служат единицы активности материала и

характеристики активности специально введенных меченых молекул (флуохромы,

изотопы и т. п.).

Наиболее часто определение критерия положительной реакции связано с

анализом образцов из опытной и контрольной групп, описанных выше.

Определение значений чувствительности и специфичности при разных способах

оценки позволяет выявить критерий, соответствующий максимальному значению

вычисленных величин.

Принципиальное значение для определения этих критериев имеет аналитическая

вариабельность метода, т. е. величина расхождения между значениями,

полученными при многократных измерениях одной и той же пробы. Допускается,

что этот параметр должен составить не более 10% среднего значения

измеряемой величины, но не больше 25% ширины интервала величин, полученных

в контрольной группе [Власов В. В., 1988].

Большое разнообразие методов и реакций, применяемых в иммунохимическом

анализе отражает различия в течениии инфекционных процессов, многообразие

возбудителей и условий взаимодействия между микро- и макроорганизмом. Но

также, как не может существовать единственного средства лечения всех

болезней, нет панацеи и в диагностическом смысле.

Итак, проведение аналитических процедур при подозрении на инфекционное

заболевание, должно быть направлено на обнаружение патогенного агента

(вируса, бактерии, простейшего и т. п.), а также иммунологического ответа

макроорганизма на этот агент. Классическая триада Коха в подавляющем

большинстве случаев является недостижимым условием диагностики вирусных и

бактериальных заболеваний, в меньшей степени - паразитарных. Многочисленные

исследования бессимптомного носительства вирусов и бактерий убеждают в том,

что обнаружение микроба является лишь одним из признаков, которые должны

учитываться врачом при постановке диагноза. Ситуацию осложняют частые

смешанные инфекции (ассоциации типа вирус - вирус, бактерия - бактерия и

вирус - бактерия). Кроме того, иммунный ответ на инфекционный агент не во

всех случаях носит регулярный характер (первичные и вторичные

иммунодефициты). С другой стороны, современный человек иммунизируется

достаточно большим количеством вакцин, что может маскировать развитие

сопутствующей инфекции. В связи с этим, процесс установления диагноза, в

том числе с помощью иммунохимических методов, следует рассматривать как

вероятностный. Привлечение дополнительной информации (расширение

симптоматики) можно считать способом увеличения вероятности установления

правильного диагноза. Для инфекционных заболеваний, несмотря на конкретный

тип или вид возбудителя, можно назвать три основных процесса, которые

определяют вероятность идентификации этиологического агента:

- наличие в макроорганизме или на ограничивающих его покровах генетического

материала микроорганизма, продукты которого прямо или опосредовано

повреждают функциональные структуры макроорганизма;

- определение в макроорганизме или на ограничивающих его покровах этих

биологически активных продуктов микроорганизма, приводящих к проявлению

симптомов, характерных для данного заболевания;

- изменение состояния иммунной системы макроорганизма под действием

микробных продуктов, направленное на их нейтрализацию.

Очевидно, что ни один из этих признаков не выявляется в 100% случаях в

любой стадии и разновидности инфекции определенного типа. Так, на стадии

выздоровления сами микробы и многие их продукты могут не определяться.

Иногда развернутая клиническая картина является следствием воздействия на

макроорганизм микроба, который быстро элиминируется из организма. При этом,

в одних случаях невозможно достоверно определить генетический материал

микроба, а в других - уже нейтрализованный антигенный материал. Иммунный

ответ, как уже отмечалось выше, может развиваться лишь через несколько

суток после начала болезни. Следовательно, в начальной стадии болезни

определение, например, наличия антител затруднительно. Но тем не менее

наличие в течение определенного периода времени одного, двух или всех трех

рассмотренных признаков пропорционально ведет к увеличению вероятности

того, что данный микроб является возбудителем. И наоборот, если ни один их

этих признаков не наблюдается, то эта вероятность стремится к нулю.

Рассматривая примеры использования различных методов для специфической

диагностики инфекционных заболеваний можно отметить, что коммерческие

препараты, используемые в мире для этих целей, относятся в основном к

методам агглютинации, преципитации, нейтрализации вирусов, ингибирования

гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, коагглютинации,

латексагглютинации, реакции связывания комплемента, иммунофлуоресценции,

ИФА. Значительно реже для этих целей используют радиоиммунологический

анализ, метод генного зондирования, а коммерческие иммуносенсоры и

липосомальные методы еще только разрабатываются. Хотя в научной литературе

есть сообщения о разных видах иммунохимического анализа, описанных или не

упомянутых в настоящей главе, немногие методы стали общепринятыми.

Для бактериальных инфекций в некоторых случаях сохраняется

использование методов прямой агглютинации бактерий для идентификации их

чистой культуры (при респираторных, кишечных инфекциях) либо определение

Таблица: Возможности использования коммерческих препаратов для различных

методов лабораторной диагностики при инфекциях у человека.

|Метод |Определяемый|Инфекционная |

| |компонент |патология(возбудитель) |

|Прямая агглютинация|Антигены, |Кишечные инфекции (Sallmonella,|

| |антитела |Shigella, Escherichia, Proteus,|

| | |Brucella),Респираторная |

| | |инфекция (B. Pertussis, |

| | |Legionella, N.meningitidis, |

| | |S.Pneumoniae, Staphylococcus, |

| | |Streptococcus), Listeria |

| | |monocytogenes, T.gondii |

|Торможение прямой |Антитела |Вирусы ЕСНО-коксаки, гриппа, |

|гемагглютинации | |парагриппа, паротита, кори, |

| | |реовирусы |

|Нейтрализация |Антитела |М.Pneumoniae, Вирусы |

| | |ЕСНО-коксаки, аденовирусы, |

| | |гриппа, парагриппа, |

| | |полимиелита, реовирусы |

|Перциптация |Антигены, |Гистоплазмоз, кокцидиоидомикоз,|

| |антитела |бластомикоз, аспергиллез. |

| | |кандидоз, сифилис |

|Коааглютинация |Антигены |Кишечные инфекции (Shigella, |

| | |энтеротоксикогенные E. Coli), |

| | |менингит (N.meningitidis, |

| | |S.Pneumoniae, H. Influenzae) |

|Латексагглютинация |Антигены, |менингит (N.meningitidis, |

| |антитела |S.Pneumoniae, Streptococcus, |

| | |H.Influenzae ), E. Coli, |

| | |S.aureus, Cl. Perfingens, |

| | |эхинококкоз, мононуклеоз, |

| | |краснуха, криптококкоз, |

| | |цитомегаловирус. |

|РПГА |Антитела |Yersinia, Staphylococcus, |

| | |мононуклеоз, краснуха, |

| | |трипаносомоз, шистомоз, |

| | |лейшманиоз, эхинококкоз, |

| | |амебная дизентерия |

|Реакция связывания |Антитела |Большинство патогенных вирусов,|

|комплемента | |бактерий, Chlamidia, |

| | |М.Pneumoniae, рикетсии, |

| | |Р.Capsulatum, B.dermatitidis, |

| | |C.immitis, Aspergillus |

|Иммунфлуоресценция |Антигены, |Aденовирусы, Вирусы |

| |антитела |ЕСНО-коксаки, цитомегаловирус, |

| | |вирус простого герпеса, гриппа,|

| | |краснухи, гепатита В, |

| | |М.Pneumoniae, Большинство |

| | |патогенных бактерий, |

| | |E.Histolytica |

|Иммуноферментный |Антигены, |Большинство патогенных |

|анализ |антитела |бактерий, вирусов, грибы, |

| | |простейшие |

|Генные зонды |Нуклеиновые |М.Pneumoniae, L.Pneumoniae, |

| |кислоты |Aденовирусы, Вирусы |

| | |ЕСНО-коксаки, гепатита A и В, |

| | |вирус простого герпеса, ВИЧ-1, |

| | |ВИЧ-2, папиломавирус |

антител (кишечные инфекции), хотя значение этих реакций в сравнении с

другими более чувствительными, постепенно снижается. Такая же

закономерность наблюдается и при использовании методов прямой агглютинации

при паразитарных заболеваниях.

Для вирусных инфекций аналогом является метод прямой гемагглютинации.

Однако, из-за его относительно невысокой специфичности, практически более

важным является метод ингибирования (торможения) реакции гемагглютинации с

целью определения антител к вирусу. Для этих же целей используют метод

нейтрализации вирусов, однако он более трудоемок из-за необходимости

поддержания культуры вируса.

На смену этим реакциям при бактериальных, вирусных и паразитарных

инфекциях приходят методы коагглютинации (определение антигенов) и

латексагглютинации (определение антигенов, либо антител). Эти методы

находят все большее практическое применение, особенно при диагностике

менингитов, респираторных и некоторых кишечных инфекций. Реакция пассивной

агглютинации по-прежнему популярна при диагностике паразитарных

заболеваний, реже при определении антител к вирусам (краснуха,

мононуклеоз).

Реакция связывания комплемента используется для определения антител

при большинстве видов инфекций, а особенно широко - при вирусных

заболеваниях и болезнях, вызываемых риккетсиями, микоплазмами и т. п.

Однако в последнее десятилетие этот метод вытесняется ИФА.

Иммунофлюоресцентный метод для определения антигенов и антител в силу

своей универсальности также распространен при различных видах инфекционной

патологии. В обычных вариантах он основан на микроскопии и визуальном

наблюдении. Это одновременно и недостаток (субъективная оценка) и

достоинство (наглядность), что в значительной мере руководит при его выборе

врачом, в зависимости от целей анализа. Модификации последних лет,

основанные на инструментальном учете, вместе с ИФА теснят другие

иммунохимические методы.

Радиоиммунологический анализ для диагностики инфекций применяется для

подтверждения некоторых форм гепатита В, а также СПИДа. Расширение области

его использования в практике диагностики инфекционной патологии мало

вероятно.

Иммуноферментный анализ для определения антигенов и антител к

микроорганизмам находит все более широкое применение в практике. В

настоящее время по частоте применения он не уступает, а в многих случаях

(гепатиты, СПИД) превосходит другие методы иммунохимического анализа. При

бактериальных, вирусных, паразитарных заболеваниях с его помощью определяют

различные антигены микробов и антитела к ним, относящиеся к разным классам

иммуноглобулинов.

Практически важным при выявлении антигена любым методом иммунохимического

анализа является представление о природе искомого антигена. В некоторых

случаях система анализа ориентирована лишь на определенный тип антигена,

характерный для определенного типа инфекции. Например, при диагностике

коклюша можно определять различные компоненты бактерии - ЛПС, различные

белки и т. д. Однако наиболее существенно выявление коклюшного токсина.

Вирусы, вызывающие у человека СПИД (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) имеют общие антигены с

вирусами лейкоза крупного рогатого скота, но диагностически значимо

определять специфические гликоп- ротеины gp 24, gp 120 и т. д. То же

относится и к определению антител. При бактериальном эндокардите,

вызываемом S.aureus диагностически более значимы антитела к тейхоевым

кислотам, а при респираторной стафилококковой инфекции - антитела к

поверхностным антигенам. При использовании того или иного набора для

проведения иммунологического анализа следует определять для какого типа

заболевания определяемый признак является информативным, т. е.

увеличивающим вероятность точного диагноза.

Следовательно, в результате рассмотрения всего многообразия методов

иммунохимической диагностики, можно заключить, что необходимым является

использование различных методов, оптимальный набор которых зависит от

конкретной патологии. Так для острой респираторной инфекции кроме

классических бактериологического и вирусологического анализа можно

рекомендовать метод латексагглютинации для определения антигенов,

иммунофлуоресцентный метод для подтверждения, иммуноферментный для

определения антител. При СПИДе проводится определение вируса и антител к

нему иммуноферментным методом (иногда скрининг - методом латексаг-

глютинации) с подтверждением иммуноферментным (вестерн-блат), либо

радиоиммунологическим методом.

Цели непосредственного анализа диктуют наиболее приемлемые варианты

обследования и уровень сложности методов. Для массового скрининга

необходимы простые, но надежные и чувствительные методы

(латексагглютинация, гомогенный ИФА, иногда РПГА), позволяющие проводить

десятки и сотни анализов в сутки. Для установления первичного диагноза в

поликлиническом лечебном заведении, для анализа образцов в лаборатории СЭС

необходимы относительно простые методы, но с более высокими показателями

чувствительности (ИФА, РИА). При обследовании пациента в специализированной

клинике комплекс таких методов должен быть как можно более широким, включая

и длительные наблюдения динамики развития процесса, иммуногистологический

анализ (в том числе - иммунофлуоресцентный), генное зондирование и т. д.

Последовательное применение изложенных принципов, на наш взгляд, позволит

наиболее эффективно использовать преимущества высокочувствительных и

информативных методов иммунохимического анализа для диагностики

инфекционных заболеваний человека.

Список литературы:

1. Ройт А. “Основы иммунологии” Мир 1990 г.

1. Руководство “Иммунология инфекционного процесса” Москва 1994 г.

1. В.Г. Галактинов “Графические модели в иммунологии” Медицина 1986 г.

1. Р.В. Петров “Иммунология” Медицина 1987 г.

1. А.М. Егоров “Теория и практика иммуноферментного анализа” Высшая школа

1991 г.

1. У.П. Коллинз “Новые методы иммуноанализа” Мир 1991 г.

1. Каталог фирмы Biorad 1996 г.

1. Материалы занятий и лекции по микробиологии 1995 - 1996 год.

-----------------------

Гель с исследуемым образцом после электрофореза

5-бромо-4-хлоро-3-индол фосфат (BCIP),

нитросиний тетразоль (NBT)

Хемилюминесцентное определение

Усиление

окраски

4хлоро-1-нафтол, 3,3’-диамино- бензидин (DAB)

Усиление окраски

Коньюгаты биотина, стрептовидин

Коньюгаты щелочной фосфатазы

Коньюгаты золота

Коньюгаты пероксидазы хрена

Инкубация с реагентом

Инкубация со специфическими антителами

Блок неспецифических мест связывания

Амидо черный или кумаси синий (R-250)

4- хлоро - 1 -нафтол (4CN)

Красители из коллоидного золота

Биотиновые плашки для блоттинга

Аннионые красители

Определение антигена

Определение белков

Перенос разделенных белков на мембрану

Страницы: 1, 2, 3