Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК

СОКРАЩЕНИЙ..................................................................

............................3

ВВЕДЕНИЕ....................................................................

.........................................................4

ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................

....................................5

СТРОЕНИЕ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ............................................................

.......................5

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ

ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У

МЛЕКОПИТАЮЩИХ...............................................................

.....7

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ

ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ

ПОЗВОНОЧНЫХ......................................................11

ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ

ИГ..........................................................................

.............19

МАТЕРИАЛЫ И

МЕТОДЫ......................................................................

.....................24

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ДНК.........................................................................

...................................24

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ

ГЕЛЯ........................................................................

.........................24

ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ

ЗОНДОВ......................................................................

25

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ

ДНК.........................................................................

.............26

ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ

CsCl........................................26

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ

КЛЕТОК...................................................27

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ

РЫБ.................................................................28

ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ

ЛЕЙКОЦИТОВ.....................................................28

ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК

ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ

КЛЕТОК......................................................................

...............28

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ

кДНК......................................................................29

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ

РЕАКЦИЯ.....................................................................

..........33

СУБКЛОНИРОВАНИЕ

ДНК.........................................................................

..........................34

СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ

кДНК........................................................................

................34

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

ДНК.............................35

САУЗЕРН БЛОТ

ГИБРИДИЗАЦИЯ................................................................

.....................36

РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................

...................................................38

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ

СКРИНИНГ.....................................38

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ

СТРУКТУРЫ...................................................................

...40

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ

СТРУКТУРЫ..............................................40

АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ

ОРГАНИЗАЦИИ.................................................................

.............41

ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................

..................................................46

ВЫВОДЫ......................................................................

.........................................................48

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................

..............................49

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИГ

иммуноглобулины

пн

пар нуклеотидов

тпн тысяч

пар нуклеотидов

е.а.

единица активности

ИПТГ

изопропилтиогалактозид

ТЕМЕД N,N,N,'N'-тетраметил-этилен-

диамин

трис

трис(гидроксиметил)аминометан

дНTФ

дезоксиаденозинтрифосфат

ддНТФ

дидезоксинеклеотидтрифосфат

дНТФ

дезоксинуклеотидтрифосфат

рATФ

рибоаденозинтрифосфат

ДТТ

дитиотрейтол

Na2ЭДТА этилендиаминтетраацетат

натрия

SDS

додецилсульфат натрия

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-

галактозид

ВВЕДЕНИЕ

В основе функционирования гуморального иммунитета у млекопитающих

лежит сложный комплекс молекулярно-генетических и физиологических

механизмов, обеспечивающих реорганизацию, мутагенез и клональную экспрессию

генов иммуноглобулинов. Возникновение этой подсистемы иммунитета связывают

с появлением хрящевых рыб.

На ранних этапах эволюции гены ИГ были организованы в виде

повторяющихся кластеров V-J-C генных сегментов. При подобной организации

разнообразие продуцируемых антител основывалось, прежде всего, на

количестве имевшихся в геноме кластеров, каждый из которых кодировал один

вариант полипептидных субъединиц ИГ. В ходе дальнейшей эволюции произошел

переход от кластерной к сегментарной организации, обеспечивающей

дополнительный источник разнообразия за счет комбинативной рекомбинации

генных сегментов. Предполагается, что этот переход также имел важное

значение для регуляции экспрессии генов и осуществления механизмов

клонального отбора антителопродуцирующих клеток в ходе иммунного ответа.

Настоящая работа представляет собой часть проекта, направленного на

изучение эволюции механизмов изотипического исключения генов легких цепей

ИГ у низших позвоночных. Целями работы являлись изучение структуры и

организации генов легких цепей ИГ стерляди (Acipenser ruthenus),

представителя филогенетически древней группы костно-хрящевых рыб.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Иммуноглобулины выполняют в организме позвоночных функцию гуморальных

антител и антиген-связывающих рецепторов В-лимфоцитов. Особенностью этого

класса белков является огромное разнообразие, позволяющее им вступать во

взаимодействие с фактически любыми биологическими макромолекулами.

Типичная молекула ИГ состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух

идентичных легких (L) полипептидных цепей. H- и L-цепи построены из

нескольких доменов, каждый из которых состоит примерно из 110

аминокислотных остатков. У млекопитающих существует пять классов H-цепей:

(, m, (, (, и (. Каждая H-цепь построена из одного N-концевого и нескольких

(трех или четырех) C-концевых доменов. N-концевые домены различаются в

разных молекулах и называются вариабельными (V) доменами. C-концевые домены

имеют одинаковую структуру у молекул одного класса и называются

константными (С) доменами (рис. 1) (Пол, 1987).

Среди L-цепей млекопитающих различают два типа: лямбда и каппа.

Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного и одного константного

доменов. В индивидуальной молекуле ИГ присутствует только один тип L-цепи

(Roitt et al., 1993).

Гигантское разнообразие ИГ обеспечивается прежде всего тем, что V и C

области кодируются разными генами (генными сегментами), физически

разнесенными в зародышевой ДНК.

В формировании вариабельных доменов H-цепей участвуют три генных сегмента:

вариабельный (V), D-сегмент (от англ. diversity- разнообразие) и J-сегмент

(от англ. joining- соединяющий). С-области Н-цепей разных классов

кодируются отдельными генами (Roitt et al., 1993).

Рис. 1. Схема строения молекулы иммуноглобулина.

Типичная молекула иммуноглобулина содержит две идентичные легкие (L)

и две идентичные тяжелые (H) цепи, связанные между собой ковалентно

дисульфидными связями. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного (VL) и

одного константного (СL) домена. Н-цепь состоит из одного VH и нескольких

CН доменов.

В формировании зрелого гена L-цепи участвуют три генных сегмента: V-

сегмент и J-сегмент кодируют V-домен, C-сегмент кодирует константный домен.

На поздних стадиях развития В-лимфоцита генные сегменты, кодирующие

вариабельные домены, объединяются в различных сочетаниях, образуя матрицу

для экспрессии L- и H-цепей (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984).

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Различные виды млекопитающих имеют сходную схему организации и

экспрессии генов ИГ. Одним из наиболее изученных в этом отношении видов

является человек. Лямбда и каппа цепи ИГ у человека кодируются генами,

расположеными в разных локусах и на разных хромосомах. Каппа локус состоит

из большого количества V( генных сегментов, собраных в группы, пяти J( и

одного С( сегмента.. Такой тип организации называется сегментарным (рис.

2). Лямбда локус состоит из группы V( сегментов, точное количество которых

неизвестно, и семи пар J(-C( сегментов. Три из них (JC(4 - JC(6) являются

псевдогенами (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).

В процессе развития В-лимфоцита в кроветворных органах один из V

сегментов соединяется с одним из J сегментов посредством сайтспецифической

рекомбинации (Schatz et al., 1992). В этот процесс вовлекаются специальные

олигомерные последовательности: гепта- и нонамеры, фланкирующие с 3'

стороны V сегмент и с 5' стороны J сегмент (рис. 3) (Aguilera et al., 1987;

Hesse et al., 1989). Отличительной особенностью лямбда и каппа локусов

является конфигурация промежутков между гепта- и нонамерами, называемых

спейсерами. С V и J генными сегментами лямбда типа ассоциированы 23 пн и 12

пн спейсеры соответственно, а с V и J сегментами каппа типа - 12 пн и 23 пн

спейсеры (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).

л

Рис. 2. Схема строения лямбда и каппа локусов генов L-цепей ИГ

человека.

Лямбда локус содержит много V( сегментов и семь пар

близкорасположенных J(-C(. Три из них яляюся псевдогенами ((). Каппа локус

содержит много V( пять J( и один C( генный сегмент (Hieter et al., 1981;

Roitt et al., 1993).

Обозначения: - сигнальные олигомеры.

Рис. 3. Схема расположения олигонуклеотидных последовательностей,

задействованных в сайтспецифической рекомбинации в каппа локусе

млекопитающих. Эти последовательности фланкируют с 3‘ стороны VL сегмент и

с 5’ стороны JL сегмент. Во время рекомбинации гептамер и нонамер одного из

VL сегмента объединяются с гептамером и нонамером одного из JL сегмента.

Это делает возможным соединение VL и JL сегментов без нарушения рамки

трансляции (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989).

Обозначения: - сигнальные олигомеры.

Последовательность, в которой рекомбинируют локусы L-цепей, строго

упорядочена во времени. Показано, что первыми перестраиваются локусы каппа

типа, причем если в одной хромосоме перестройка оказалась нефункциональной,

тоесть не привела к появлению полноценного гена, то рекомбинация происходит

в каппа локусе на гомологичной хромосоме. В случае повторной абортивной

перестройки аналогично происходят перестройки в лямбда локусах. Если в

клетке непродуктивно перестроились все четыре локуса, то она превращатся в

0-клетку и подвергается апоптозу. Если же перестройка одного из локусов

привела к образованию функционального гена, то рекомбинация остальных

локусов блокируется. Детали механизма блокирования неизвестны, однако

установлено, что необходимым условием для него является транскрипция

продуктивно перестроенного гена. В результате в каждом индивидуальном

лимфоците синтезируется только один тип L-цепей, каппа или лямбда, и

экспрессия гена происходит только на одной из двух гомологичных хромосом.

Эти феномены, называемые изотипическим и аллельным исключениями лежат в

основе ключевого принципа функционирования иммунной системы - принципа

клональной селекции (Пол, 1987; Strob, 1987).

В организме млекопитающих генерируется свыше десяти миллионов

вариантов антител, хотя в геноме содержится значительно меньшее количество

генных сегментов, которые могут участвовать в формировании вариабельных

доменов. В случае L-цепей, основным источником разнообразия является

комбинативное сочетание V и J сегментов. Дополнительным источником является

смещение рекомбинационной рамки в месте их соединения. Кроме того, V генные

сегменты могут обмениваться участками ДНК с псевдогенами посредством генной

конверсии. Очень существенный вклад в разнообразие специфичностей антител

вносит соматическое мутирование вариабельных генных сегментов в сайтах,

участвующих в формировании антигенсвязывающего центра. Соматическое

разнообразие генерируется при вторичном иммунном ответе путем включения

гипермутационного механизма в клетках памяти в зародышевых центрах

лимфатических узлов (Tonegawa 1983; Roitt et al., 1993).

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ

ПОЗВОНОЧНЫХ

Хрящевые рыбы.

Гуморальный иммунный ответ в виде специфических антител

обнаруживается только у позвоночных. Наиболее примитивными видами, у

которых обнаружена способность синтезировать ИГ, являются хрящевые рыбы.

Представители трех основных таксонов (акулы, скаты и химеры) продуцируют

антитела в ответ на введение широкого спектра антигенов. Однако, в отличие

от млекопитающих, гетерогенность сывороточных антител у хрящевых рыб

выражена очень слабо. Кроме того, у них не обнаружено созревание иммунного

ответа - при вторичном введении антигена спектр антител не меняется

(Flajnik, 1996). Результаты исследований последних лет продемонстрировали,

что организация генов ИГ у хрящевых рыб также имеет ярко выраженные

особенности.

У хрящевых рыб обнаружены гены трех типов L-цепей, локализующиеся в

разных локусах. В каждом локусе геные сегменты организованы в кластеры,

имеющие по одному V, J и C генному сегменту (рис. 4). Таких кластеров

содержится несколько десятков или даже сотен в одном локусе на расстоянии

12-15 тпн друг от друга (Rast et al., 1994).

Гены первого типа найдены у разнозубой акулы (Heterodontus francisci)

(Shamblott and Litman, 1989) и малого ската (Raja erinacea) (Anderson et

al., 1995). У акулы кластеры имеют размер 3-6 тпн. V и J, J и C генные

сегменты разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. У ската V и J

сегменты слиты в зародышевой ДНК.

Гены второго типа обнаружены у пятнистой химеры (Hydrolagus colliei)

(Maisey, 1984), песчаной акулы (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al.,

1992; Hohman et al., 1993), разнозубой акулы и малого ската (У всех

изученных видов в кластерах этого типа V и J генные сегменты соединены уже

в зародышевом геноме. V и C гeнные сегменты разделены 2-3 тпн.

Рис. 4. Схема строения локусов генов L-цепей ИГ у акулы.

Организация генов у акулы имеет кластерный тип. Каждый кластер имеет

размер 3 - 6 тпн и содержит по одному VL, JL и CL генному сегменту.

Обнаружено три типа генов L-цепей ИГ. Локусы генов первого и третьего

типов имеют схожую организацию. В этом случае VL и JL, JL и CL сегменты

разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно (А) (Rast et al., 1994).

В локусе генов второго типа VL и JL сегменты соединены уже в

зародышевом геноме (Б).

Третий тип генов L-цепей найден у акулы-няньки (Gynglimostoma

cirratum) (Greenberg et al., 1993) и разнозубой акулы (Rast et al., 1994).

В кластерах этого типа V и J, J и C генные сегменты разделены, как и в

кластерах первого типа, примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. V и J генные

сегменты фланкируются сайтами специфической рекомбинации со спейсерами 12 и

23 пн, что соответствует конфигурации спейсеров в локусах каппа типа

млекопитающих. По первичной структуре гены третьего типа тоже наиболее

близки к генам каппа типа высших позвоночных (гомология по аминокислотной

последовательности составляет около 60%).

Гены этих трех типов имеют между собой низкую степень гомологии:40-

50% по нуклеотидной последовательности С сегментов и 50-60% по

последовательности V сегментов (Hohman et al., 1993).

Полученные данные показывают, что у хрящевых рыб имеется очень

большое количество генных сегментов. Однако специфика организации генов

исключает комбинативное сочетание сегментов. Все разнообразие антител у

хрящевых рыб формируется только за счет экспрессии большого количества

кластеров.

Данные о нуклеотидных последовательностях из разных локусов выявили

низкую гетерогенность генов (85-95%), что указывает на отсутствие

соматического мутагенеза (Rast et al., 1994).

Костистые рыбы.

Анализ сывороточных антител пещерного сомика (Ictalurus punctatus)

показал наличие трех типов L-цепей с различными молекулярными массами: 26,

24 и 22 кДа. Два вида антител мыши, 3F12 и 1G7, захватывают более 90% от

общего количества иммуноглобулинов в реакции иммунопреципитации. При этом

3F12 антитела связываются с молекулами, содержащими L-цепи массой 24 и 22

кДа, а 1G3 антитела с другой субпопуляцией, содержащей L-цепи массой 26

кДа. На основе этих данных L-цепи разделяют на два класса, называемые F и G

(Lobb et al.,1984).

Геномная организация локуса L-цепей G типа имеет кластерный тип (рис.

5). В каждом кластере содержится по одному J и C сегменту и два V сегмена.

Вариабельные генные сегменты расположены всегда в противоположной

транскрипционной полярности к J и C сегментам . В ряде геномных клонов один

V сегмент располагался с 3' стороны от C генного сегмента. Размер кластера

равен примерно 3 тпн, расстояние между кластерами около 6 тпн (Ghaffari and

Lobb, 1993; Bengten, 1994).

Хотя гены L-цепей сомика имеют низкую гомологию с генами других

позвоночных (40-50% по нуклеотидной последовательности), их можно отнести к

каппа типу высших позвоночных, так как сходство по первичной структуре с

лямбда типом ниже. Кроме того, конфигурация спейсеров имеет характер каппа

типа: 12 пн спейсер ассоциирован с V, 23 пн спейсер с J сегментом (Ghaffari

and Lobb, 1993).

У радужной форели (Oncorhynchus mykiss), представителя другого

семейства костистых рыб, также обнаружены два типа L цепей (Daggfeldt et

al., 1993). Один из них (L1) высокогомологичен G типу сомика по структуре V

и C областей и соответствующий локус имеет сходную организацию.

По-видимому, у этих видов объединение V и J сегментов происходит

только за счет инверсий с восстановлением единой полярности транскрипции.

Разнообразие вариабельных доменов образуется в результате комбинативного

сочетания V и J сегментов в пределах одного кластера. Не исключается, что в

перестройки могут вовлекаться и соседние кластеры.

Интересной особенностью костистых рыб является очень высокая

пропорция мРНК, представляющей так называемые стерильные транскрипты

(Ghaffari and Lobb, 1993). Эти транскрипты включают в себя только С-

сегменты и фланкирующие их 5’и 3’-нетранслируемые участки. Количество

стерильных транскриптов у сомика и форели в 5 раз превышает количество

полных VJC-транскриптов.

Рис. 5. Геномная организация локуса генов L-цепей ИГ у пещерного

Страницы: 1, 2, 3, 4