Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

сомика.

Генные сегменты организованы в кластеры. Каждый кластер содержит два

VL и по одному JL и CL сегменту и имеет размер около 5 тпн. Расстояние

между JL и CL около 1000 пн, VL сегменты удалены от 5' конца JL сегмента на

3 тпн. VL сегменты всегда расположены в противоположной транскрипционной

полярности по отношению JL и CL сегментам (Ghaffari and Lobb, 1993).

Амфибии.

У шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) выявлено три семейства генов L-

цепей ИГ, кодирующих три различных изотипа: L1 (ро), L2 (сигма) и L3 (рис.

6).

Все три локуса имеют сегментарный характер организации. L1 локус

содержит множественные VL1 сегменты, разделенные в геноме 2.1 - 3.6 тпн,

пять JL1 сегментов, три из которых идентичны, и один CL1 генный сегмент

(Stewart et al., 1993). JL1 и VL1 сегменты фланкируются каноническими гепта-

и нонамерными сигнальными последовательностями, разделенными 12 пн у VL1 и

23 пн у JL1 сегментов (Sakano et al., 1980).

Локус генов второго типа разделяется на два семейства, (1 и (2,

которые в геноме располагаются отдельно. Геном лягушки содержит

множественные V(1 и несколько V(2 геных сегментов, одну пару J(1-C(1 и пару

J(2-C(2 (Schwager et al., 1991). Расположение генов этого типа друг

относительно друга точно не определено.

Недавно был обнаружен третий тип генов L-цепей у лягушки. В геноме

лягушки содержится шесть семейств V сегментов этого типа. Общее количество

VL3 элементов составляет по меньшей мере 30 копий. Каждый VL3 элемент может

рекомбинировать с одной из двух пар JCL3 генных сегментов (Haire et al.,

1996).

Гены трех типов значительно различаются: гомология на аминокислотном

уровне составляет приблизительно 30% (Zezza et al., 1991). В то же время,

ряд признаков позволяет соотнести гены L1 и L3 типа с каппа и лямбда типами

млекопитающих.

Семейство генов первого типа можно отнести к каппа типу по нескольким

причинам (Zezza et al., 1992): а) высокая гомология первичной структуры

(более 50%); б) существенное сходство геномной организации локуса (много

VL1 и один CL1 генный сегмент); в) кофигурация спейсеров между гепта- и

нонамерыми соответствует каппа типу; г) JL1 и CL1 генные сегменты разделены

примерно 3.5 тпн, что приблизительно равно расстоянию между JL( и CL(

элементами человека (Sakano et al., 1979; Hieter et al., 1982) и

значительно больше чем расстояние между JL( и CL( млекопитающих (Blomberg

et al., 1982; Udey, 1987).

Рис. 6. Геномная организация локуса первого и третьего типов генов L-

цепей ИГ у шпорцевой лягушки.

Локус семейства L1 содержит множественные VL1 сегменты, пять JL1

сегментов один CL1 генный сегмент. Расстояние между VL1 равно 2.1 - 3.6

тпн. Локус семейства L3 имеет около 30 VL3 сегментов, располагающихся

группами, JL3 и CL3 сегменты располагаются парами: JCL31 и JCL32 (Stewart

et al., 1993; Haire et al., 1996).

Третий тип генов L-цепей лягушки более близок к лямбда типу

млекопитающих: а) более высокая гомология с генами лямбда типа

млекопитающих (около 50% с (- и 30-40% с (-типом по аминокислотной

последовательности); б) JL3 и CL3 генные сементы экспрессируются всегда

парами JL31-CL31 и JL32-CL32, что напоминает ситуацию в лямбда локусе

человека и мыши (Haire et al., 1996).

Гены второго типа L-цепей лягушки незначительное и приблизительно

одинаковое сходство с генами каппа и лямбда типов млекопитающих (30-40% и

25-40% по нуклеотидной последовательности, соответствено) (Schwager et al.,

1991).

Генетическое разнообразие у лягушки достаточно велико и сравнимо с

разнообразием генов у млекопитающих. Однако репертуар антительных

специфичностей в сыворотке крови значительно уступает репертуару высших

позвоночных (Hsu et al., 1991). Этот парадокс можно объяснить наличием

механизма соматической селекции клонов В-лимфоцитов, который элиминирует

клетки, несущие антитела, специфичные к собственным антигенам организма, а

также те клетки, которые продуцируют несколько типов антител (Wilson et

al., 1992).

Основной вклад в формирование разнообразия L-цепей антител у лягушки

дают первое и третье семейства генов, имеющие высокий комбинативный

потенциал и большое разнообразие зародышевых V генных (Haire et al., 1996).

Второе семейство имеет несколько слабо отличающихся друг от друга VL2

элементов и не играет существенной роли в формировании разнообразия

(Stewart et al., 1993). Таким образом, разнообразие генов L-цепей у лягушки

а создается посредством: а) комбинативного соединения V и J генных

сегментов; б) смещения рекомбинационной рамки при соединении V и J

сегментов. Нельзя исключить, что определенный вклад в разнообразие может

вносить соматический мутагенез. Во всяком случае, наличие этого механизма

показано для генов H-цепей лягушки (Zezza et al., 1992).

ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ

Согласно наиболее популярной в настоящий момент гипотезе гены ИГ и Т-

клеточных рецепторов произошли от одного предкового гена, кодировавшего

один домен путем различных вариантов последовательных дупликаций (рис. 7).

В эволюции генов ИГ можно выделить три основных события.

1. Разделение предкового V-подобного гена на V и J сегменты и

возникновение механизма генерации разнообразия путем соматической

рекомбинации. Предпологается, что это событие связано с внедрением

транспозона в предковый ген и осуществилось до разделения ИГ и Т-клеточных

рецепторов у предков хрящевых рыб (Gilbert, 1990). Наличие в геноме акул и

скатов слитых VJ генов в локусах L-цепей классов I и II, является, по-

видимому, вторичным событием и, возможно, обусловлено фиксацией генов,

кодирующих антитела строго определенной специфичности (Anderson et al.,

1995).

2. Возникновение механизмов соматического мутагенеза генов ИГ. У

млекопитающих соматический мутагенез обеспечивает как минимум половину

разнообразия антител, являясь основой аффинного созревания антител при

вторичном иммунном ответе (Пол, 1987). Достаточно выражен соматический

мутагенез также у птиц (Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al., 1987).

Ряд данных позволяет предполагать, что соматический мутагенез может

осуществляться у хрящевых рыб и у амфибий, но эти результаты нуждаются в

более тщательном изучении. В частности, у хрящевых рыб получение

достоверных свидетельств затруднено наличием множественых кластеров генов,

что не позволяет надежно соотносить данные по геномной структуре и

структуре кДНК (Litman et al., 1993).

3. Переход от кластерной к сегментарной организации генных сегментов.

Сегментарная организация может иметь несколько преимуществ. Во-первых,

увеличивается разнообразие продуцируемых антител за счет дополнительных

возможностей комбинирования разных V и J сегментов. Во-вторых, уменьшается

размер локуса за счет

Рис. 7. Гипотетическая схема эволюции структурной организации локусов

генов L-цепей ИГ позвоночных. (Anderson et al., 1995; Gilbert, 1990).

Обозначения: - сигнальные олигомеры, фланкирующие V и J сегменты.

резкого сокращения количества C генов. В-третьих, подобная организация

позволяет упростить регуляцию экспрессии различных локусов.

Ключевым принципом функционирования иммунной системы является принцип

клональной селекции иммунокомпетентных клеток, несущих рецептор

определенной специфичности. Ряд косвенных данных позволяет считать, что у

акул гуморальный иммунный ответ клонально ограничен (Shankey and Clem,

1980). Однако неизвестно, каким образом и насколько эффективно

осуществляется это ограничение (Flajnik, 1996). У млекопитающих принцип

“одна клетка - одно антитело” обеспечивается благодаря изотипическому и

аллельному исключению. При сегментарной организации генов продуктивная

перестройка в одном из локусов ведет к блокированию перестройки других

локусов и, тем самым к их инактивации. Однако, в случае наличия

множественных VJC кластеров, в части из которых VJ сегменты слиты в

зародышевой ДНК, механизмы контроля выборочной экспрессии могут быть более

сложными или не столь эффективными. Таким образом, переход от кластерной к

сегментарной форме организации генов ИГ мог иметь принципиальное значение

для формирования полноценной системы гуморального иммунитета.

Вопрос о том, на каком этапе филогенеза произошел этот переход

остается открытым. Уже у амфибий гены ИГ L- и Н-цепей организованы

сегментарно. При этом, в случае L-цепей наблюдается два основных типа

организации: каппа-подобный (один С ген, семейство J сегментов и семейство

V сегментов) и лямбда подобный (несколько пар JC и семейство V сегментов).

По всей видимости, различные типы L-цепей амфибий произошли от различных

типов L-цепей хрящевых рыб, однако относительно невысокая гомология по

первичной структуре не позволяет утверждать этого с определенностью

(Gilbert, 1990).

У сомика и радужной форели, представителей костистых рыб, организация

генов L-цепей и Н-цепей отличается. Гены Н-цепей костистых рыб организованы

подобно млекопитающим сегментарно (Bengten et al., 1991). Организация генов

L-цепей имеет кластерный характер. В то же время, в отличие от хрящевых

рыб, транскрипционная ориентация V генов у них изменена.

Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно

специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно (Рис.

8). Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут

представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966).

В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и

организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые

являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше

настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения

относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих

(предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И., 1941),

очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили

черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием

могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и

амфибиями.

Рис. 8. Эволюционное древо низших позвоночных ( по Северцеву А. Н.,

1939).

Обозначения: - таксоны, имеющие ныне живущих представителей, -

таксоны, существование которых доказано палеонтологическими исследованиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК

В агарозном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере

ТАЕ, имеющем состав: 0.04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др.,

1984).

В полиакриламидном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0,5-кратном

буфере ТБЕ, имеющем состав: 0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 2

мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10%

раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др., 1984).

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ

Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.

Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой

ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на

диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0,5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК

(2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы

проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем

состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8,0 (Маниатис и др., 1984).

Адсорбция на кремниевой пудре.

Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали

участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М

раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой

пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300

мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После

этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и

дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ

трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с

силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995).

Замораживание - оттаивание.

Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали

центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к

супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при

12000 g в течение 10 мин.

ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ

500 нг ДНК-матрицы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при

100оС в течение 10 мин и быстро охлаждали до 0оС. Затем добавляли 10 мкл 10-

кратного буфера (40 мМ KP04 рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2 и 1,0 мМ 2-

меркаптоэтанол), 0,1-0,5 мКи 32Р-dATФ, 10 мкл 2 мМ раствора трех других

немеченых дНTФ до концентрации 200 мкМ. Объем реакционной смеси доводили

водой до 100 мкл, добавляли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12

е.а.) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку

зонда проводили методом гель - фильтрации на колонке с биогелем П-10

(Маниатис и др., 1984).

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Клетки Escherichia coli, выращенные в среде Луриа-Бертани (1% NaCl,

1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, рН 7,5) (среда LB) с

ампициллином (50 мкг/мл), осаждали центрифугированием при 4000 g. Затем

осадок суспендировали в буфере STET (8% сахароза, 0,5% тритон X-100, 10 мМ

трис-HCl и 50 мМ Na2ЭДТА, рН 8,0) и добавляли лизоцим до концентрации 0,8

г/мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и при

100оС в течение 1 мин. После этого клеточный дебрис осаждали

центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин.

Для осаждения плазмидной ДНК к супернатанту добавляли 1/10 объема 3 М

раствора ацетата натрия, равный объем изопропанола и центрифугировали при

16000 g в течение 15 мин при 20оС. Затем промывали осадок добавлением 80%

этанола и повторным центрифугированием в течение 5 мин при 20оС (Маниатис и

др., 1984).

ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В

ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl

На каждые 10 мл раствора плазмидной ДНК, полученного после осаждения

лизированных клеток (см. Выделение плазмидной ДНК), добавляли 1 г сухого

CsCl, соль растворяли, после чего на каждые 10 мл раствора добавляли 0,8 мл

раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. Смесь помещали в

центрифужные пробирки Beckman, заполняли доверху раствором CsCl и

бромистого этидия той же плотности и центрифугировали в роторе Ti 60 при

45000 об/мин и температуре 20оС в течение 36 часов. После этого отбирали

кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК и экстрагировали бромистый

этидий из раствора до полного обесцвечивания равным объемом н-бутанола,

предварительно насыщенного 1 М раствором NaCl.

ДНК осаждали центрифугированием при 15000 g, добавив равный объем 1 М

раствора NH4Cl и два объема этанола. После промывания этанолом осадок ДНК

растворяли в воде до концентрации 1 мкг/мкл (Маниатис и др., 1984).

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Химическая трансформация.

Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF ' и

выращивали в 100 мл 2-кратной среды Луриа (2% бакто-триптон, 1% бакто-

дрожжевой экстракт, 0,1% NaCl, 0,4% глюкоза, рН 7,0) при 37оС до оптической

плотности D550=0,35. Клеточную суспензию выдерживали при 0оС в течение 2

часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, температуре 4оС

и суспендировали в 50 мл ледяного буфера А (100 мМ CaCl2, 70 мМ MnCl2, 40

мМ NaAc, рН 5,5). После этого суспензию клеток выдерживали при 0оС в

течение 30 мин, после чего клетки осаждали и суспендировали в 5 мл буфера А

с 15% глицерина.

Для трансформации к 200 мкл суспензии компетентных клеток добавляли

30 нг плазмидной ДНК, растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0оС в

течение 30 мин. Затем инкубировали при 37оС в течение 5 мин, после чего

добавляли 3 мл среды LB и инкубировали при 37оС еще 90 мин. Клетки собирали

центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др., 1988).

Электротрансформация.

Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF '

выращивали в 100 мл среды LB (см. Химическая трансформация) при комнатной

температуре до оптической плотности D550=0,45. Затем клетки осаждали

центрифугированием при 4000 g, 4оС и промывали суспендированием

последовательно в 100 мл, 50 мл и 10мл 10% раствора глицерина при 0-4оС.

После этого клетки суспендировали в 240 мкл ледяного раствора GYT (10%

глицерин, 0,125% бакто-дрожжевой экстракт, 0,25% бакто-триптон).

Для трансформации к 40 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 1

мкл ДНК вектора (50 нг) при 0-4оС и пропускали электрический разряд

(U=18000 В). Затем добавляли 1 мл SOC (2% бакто-триптон, 0,5% бакто-

дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ

глюкоза), перемешивали, переносили в 3 мл среды SOC, прогретой до 42оС, и

инкубировали при 37оС в течение 1 часа (Wai Lin Tung and King-C. Chow,

1995).

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ

Кровь собирали на холоду через каудальную артерию с добавлением на

каждые 5 мл крови 1 мл 2,7% раствора Na2ЭДТА, рН 7,4. К выделенной крови

добавляли равный объем трис-солевого буфера (TBS) (0,14 М NaCl, 5 мМ KCl,

25 мМ трис-HCl, рН 7,4). Смесь наносили при комнатной температуре на равный

объем среды для выделения лейкоцитов, содержащей 24 части 9% фикола и 10

частей 34% верографина. После центрифугирования при 400 g в течение 30 мин

отбирали слой лейкоцитов и разводили в большом объеме буфера TBS. После

повторного центрифугирования при 300 g в течение 40 мин для лизиса

остаточных эритроцитов клетки суспендировали в растворе, содержащем 9

объемов 0,83% раствора NH4Cl и 1 объем 2,06% раствора трис-HCl, рН 7,62, до

концентрации 108 кл/мл и добавляли 5 объемов среды. После осаждения клеток

при 300 g в течение 10 мин процедуру очистки повторили (Фримель, 1987).

ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ

Осадок лейкоцитов после выделения и очистки суспендировали в 10

объемах (1 мл) раствора 1, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат

натрия, рН 7,0, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол, при комнатной

температуре. Затем добавляли 0,1 мл 2 М раствора NaAc, рН 4,0, 1 мл фенола,

0,2 мл хлороформа и перемешивали. Затем центрифугировали при 10000 g в

течение 20 мин при 4оС, отбирали водную фазу, добавляли к ней равный объем

изопропанола и осаждали РНК центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин

при 4оС (Chomczynski and Sacchi, 1987).

ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

1 г печени стерляди, замороженной в жидком азоте, растирали в тонкий

порошок и гомогенизировали в 15 мл раствора, содержащего 0,5 М Na2ЭДТА, рН

8,0, 0,5% саркозила, 100 мкг/мл протеиназы К и нагретого до 65оС. Затем

инкубировали при 50оС течение 3 часов при легком покачивании. Затем,

избегая резких встряхиваний, экстрагировали ДНК равным объемом фенола три

раза, каждый раз разделяя фракции центрифугированием при 4000 g и комнатной

температуре. Фенол предварительно очищали перегонкой и насыщали буфером,

содержащим 1 М трис-HCl, один раз и два раза буфером, содержащим 0,1 М трис-

HCl и 0,1% 2-меркаптоэтанол. Диализ ДНК проводили при 10оС в течение 12

часов против 4 л буфера, имеющего состав:

50 мМ трис-HCl, рН 8,0,

10 мМ Na2ЭДТА,

10 мМ NaCl.

Затем обрабатывали пробу РНКазой, свободной от ДНКазы,при 37оС в

течение 1 часа в концентрации 100 мкг/мл. После этого экстрагировали ДНК

равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) два раза и проводили диализ при

10оС в течение 36 часов против 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ

Na2ЭДТА, рН 7,5), меняя буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др., 1984).

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК

Выделение поли(A)+РНК.

Для ингибирования РНКазы все растворы, не содержащие трис,

обрабатывали 0,1% диэтилпирокарбонатом 12 часов при 37оС и автоклавировали.

Посуду прокаливали при 250оС в течение 4 часов. Поли(A)+РНК выделяли из

суммарной РНК лейкоцитов стерляди методом хроматографии на олиго(dT)-

целлюлозе. Для этого РНК растворяли в воде, прогревали при 65оС в течение 5

мин, добавляли равный объем 2-кратного буфера для нанесения РНК (40 мМ трис-

HCl, рН 7,6, 1 М NaCl, 2 мМ Na2ЭДТА, 0,2% SDS) и трижды пропускали через

колонку с олиго(dT)-целлюлозой. Затем промывали колонку 5-10 объемами

буфера для нанесения и 4 объемами этого же буфера, содержащего 0,1 М NaCl.

После этого элюировали поли(A)+РНК в 2-3 объемах воды, обработанной

диэтилпирокарбонатом, добавляли 2,2 объема этанола и осаждали

центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g при 4оС (Маниатис и др.,

1984).

Синтез кДНК.

Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы Stratagene.

Страницы: 1, 2, 3, 4