Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации

среду протеолитических ферментов и основных пептидов. Эти вещества

повреждают протеогликановые компоненты тканей, действуют на базальную

мембрану и вызывают некроз эндотелиальных клеток [36].

ЦИК наряду с продуктами ПОЛ вызывают нарушение проницаемости мембран,

вплоть до их разрыва, что в конечном итоге может привести к гибели клетки.

В результате появляются различные вещества пентидной природы. Из них

наибольший интерес представляют молекулы средней массы.

Являясь олигопептидами с молекулярной массой 300-5000 Дальтон, они

расцениваются как универсальный критерий эндогенной интоксикации и влияют

на ее уровень и прогноз [37, 38].

МСМ образуются в организме под воздействием повреждающих эндогенных

или экзогенных факторов различного генеза, являются промежуточными

продуктами протеолиза. [39, 57].

Пристальное внимание исследователей к МСМ объясняется высокой

биологической активностью их отдельных фракций, которые ингибируют

гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновых

кислот, мембранный транспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию,

обладают иммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропным

свойствами. Сейчас, квалификационная оценка степени тяжести состояния

больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].

Установлено, что значительная часть циркулирующих в крови СМ не

только растворена в плазме крови, но и связана с альбумином.

Человеческий сывороточный альбулин (ЧСА) – важнейший транспортный

белок, осуществляющий перенос эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в

плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.

Универсальность транспортной функции ЧСА обеспечивается его

уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы.

Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина приводит к изменению их

структуры и связывающей способности. Такие модификационные формы ЧСА

обнаруживаются при патологии [41].

О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА,

которая снижается после того, как токсические вещества займут центры

связывания в молекуле альбулина, что приводит к снижению детоксикационных

свойств организма. Изучение свойств альбулина является важным с точки

зрения как диагностики, так и лечения [42].

2. Материалы и методы исследований

1. Материал исследований

Уровень интоксикации оценивался по изменениям в крови больных

эффективной и общей концентраций сывороточного альбулина, малонового

диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и

активности каталазы.

Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных

сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для контроля набиралась группа

51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.

Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в количестве

не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения анализов

сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить и хранить при t=-

20[pic]С.

2. Методы исследований

2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой

(Конюхова В.С., 1989)

Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению уровня вторичного

продукта ПОЛ – малонового диальдегида.

Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде МДА

реагирует с 2-ТБК, образуя окрашенный розовый триметиновый комплекс с

максимумом поглощения при 535 им.

Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной

воды, 1 мл 0,6 % ТБК в ледяной уксусной кислоте. Кипятить 30 минут,

охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и 2 мл изопропанола. Центрифугируют при

6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм против контроля,

содержащего вместо плазмы воду.

Расчет: [pic] (мкМоль/л), где Е – оптическое поглащение

изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.

Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет

[pic]

концентрация МДА = [pic] (мкМоль/л).

2.2.2. Определение активности каталазы

(Королюк М.А., 1988)

Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями

молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки

крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо

сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через

10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски

измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной

пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.

Расчет: [pic] (мкат/л), где

Е – активность каталазы в мкат/л;

А – оптическая плотность холостой и опытной проб;

V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;

t – время инкубации, 600 сек;

К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный [pic].

За единицу активности каталазы принимают то количество фермента,

которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при

заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.

Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.

[pic]

[pic] (мкат/л)

2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным

методом «Фотокол»

(Творогова М.Г., 1995)

Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует

холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:

Эфиры холестерина [pic] холестерин + Ж.К.;

Холестерин + О2 [pic] холестинон + Н2О2;

Н2О2 + хромогены [pic] Н2О + окрашенный продукт.

Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта

пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после

проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t =

37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и

инкубировать 20 минут при t = 37oС. Окрашенные пробы фотометрировать при

500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно

холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной

температуре.

Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:

[pic] ммоль/л, где

ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.

Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.

2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов

в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)

Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 %

ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.

Реактивы:

1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры

растворить в 1 л дистиллированной воды)

2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.

Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива

№1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл

раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт).

Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На

спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах [pic]

при 450 нм.

Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности,

результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки.

Ответ выражают в единицах оптической плотности. [pic] - количество ЦИК в

100 мл сыворотки.

Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.

Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.

[pic]

Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:

[pic] усл. ед.

2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)

Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 %

раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции

света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.

Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В

качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный

дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет

0,123(0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25[pic]С. Центрифигируем 3000

об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл

дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете

при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254

нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах,

количественно равных показателям экстинции.

2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация

альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека

флуоресцентным методом

(Миллер Ю.И., 1994).

Принцип метода:

Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных

органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от

условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из

альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от

числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства

молекулы альбумина.

Состав набора:

Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора

используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт

ЭДТА.

Реактив II (4 ампулы по 0,7 мл). Основным компонентом является

специальное флуоресцирующее соединение, интенсивность флуоресценции

которого в сыворотке крови пропорциональна концентрации сывороточного

альбумина.

Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3 с

сывороткой позволяет определить ОКА.

Определение показателя ЭКА:

К 2,0 мл надосадочной жидкости добавить 0,025 мл реактива 2.

Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции при длине волны

возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.

Определение показателя ОКА:

В ту же пробу добавить 0,025 мл реактива 3. Перемешать. Измерить

интенсивность флуоресценции. Нормальные величины показателя ЭКА лежат в

интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.

Подготовка образцов крови к измерениям:

Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100 мл

дистиллированной воды. Перемешать. 0,025 мл сыворотки крови добавить в

пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа берут

жидкость 2,0 мл полученного образца.

Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.

3. Результаты исследования и их обсуждение

1. Определение показателей уровня интоксикации

в сыворотке крови практически здоровых людей

Нами было произведено исследование биохимических показателей – МДА,

активность каталазы, уровень холестерина, ЦИК, МСМ, Ит в сыворотке крови 51

донора в возрасте от 20 до 46 лет. Сыворотка крови доноров была получена на

ОСПК (областная станция переливания крови) г. Пензы.

Полученные результаты биохимических анализов были подвергнуты

статистической обработке, согласно методам и приемам статистического

анализа.

По данным комитета экспертов Международной федерации клинической

химии по референтным величинам рекомендуется верхняя и нижняя границы нормы

на уровне М(1,96?, состояние предболезни М(2?, состояние острой формы М(3?.

Об уровне процессов ПОЛ судили по концентрации вторичного продукта

МДА. Содержание количества МДА составляет 3,61(0,07 мкМоль/л. Это значение

близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). У 48 человек

значение содержания МДА входит в границы М(1,96?. У 3 человек (5 %)

содержание МДА соответствует значению М(2?, что соответствует состоянию

предболезни.

Активность каталазы у практически здоровых людей составила 16,7(0,15

мкат/л (табл. 3.1.1). При исследовании активности каталазы в группе доноров

отклонений за пределы М(1,96? мы не наблюдали.

Уровень холестерина, определяемый нами у практически здоровых людей

составил 4,45(0,68 ммоль/л (табл. 3.3.1.), показатели уложились в границу

референтной величины М(1,96?.

Содержание ЦИК, определяемое нами в сыворотке крови практически

здоровых людей составило 52,62(3,52 усл. ед. (табл. 3.1.1). 94 % людей по

показателям ЦИК входит в границы нормы, а 6% находятся в состоянии

предболезни.

Уровень МСМ у обследованных доноров в среднем составил 0,280(0,01

усл. ед. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл.

3.1.1). При исследовании МСМ отклонений за пределы М(1,96? мы не наблюдаем.

У практически здоровых людей определена детоксикационная нагрузка

сывороточного альбумина, т.е. определение общей и эффективной концентрации

альбумина. Токсичность по альбумину составляет 0,13(0,01 усл. ед. (табл.

3.1.1). Все значения токсичности по альбумину вошли в границы М(1,96?.

Полученные нами данные не имели существенных отличий от значений этих

показателей, имеющихся в литературе в сравнении с приложением 2.

Таблица 3.1.1.

Содержание биохимических показателей в сыворотке крови практически здоровых

людей

|Группа |n |МДА |Активност|ЦИК |МСМ |Ит |Холестер|

|обследованных | |мкМоль/л|ь |усл. ед. |усл. |усл. ед.|ин |

|Практически |51|3,61(0,0|16,7(0,15|52,62(3,5|0,28(0,|0,13(0,0|4,45(0,6|

|здоровые | |7 | |2 |01 |1 |8 |

2. Определение показателей уровня интоксикации

в сыворотке крови больных сальмонеллезом

Сыворотка крови больных исследовалась на базе центра

госсанэпиднадзора г. Пензы. Исследования биохимических показателей велись в

острую фазу заболевания и в период ранней реконвалесценции. Обследовано

нами 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет, с целью

установления показателей, характеризующих эндотоксикоз: перекисное

окисление липидов, уровень холестерина, Ит по сывороточному альбумину,

циркулирующих иммунных комплексов, молекул средней массы и активности

каталазы. Причем биохимические показатели крови в разгар заболевания

отличались от показателей в период ранней реконвалесценции.

Таблица 3.2.1.

Биохимические показатели сыворотки крови

у больных сальмонеллезом

|Группа |МДА |Активност|Ит |ЦИК |МСМ |Холестери|

|Контроль, n=51 |3,61(0,07|16,7(0,15|0,13(0,01|52,62(3,5|0.280(0,0|4,45(0,68|

|(практически | | | |2 |1 | |

|Больные (острый|7,19(0,2 |13,09(0.1|0,29(0,01|100,63(4,|0,550(0,0|6,54(0,07|

|период) n=30 | |6 | |04 |2 | |

|Больные (ранняя|3,87(0,15|15,84(0,1|0,15(0,01|68,9(2,8 |0,310(0,0|4,65(0,7 |

| | |9 | | |2 | |

|я) n=30 | | | | | | |

| |р?0,001 |р?0,01 |р?0,001 |р?0,001 |р?0,05 |р?0,01 |

Так, в ходе исследования выявлено достоверное увеличение количества

МДА в сыворотке крови больных сальмонеллезом на 99 % по отношению к

контролю, т.е. возрастает в 2 раза. Данные наших исследований

подтверждаются сведениями Л.Б. Оконенко, Л.Д. Мартыненко и другими. По

данным этих авторов концентрация МДА при сальмонеллезе возрастает в 2-2,5

раза.

Как видно из таблицы (табл. 3.2.1), у больных наблюдается

интенсификация ПОЛ.

Под воздействием сальмонеллезного токсина происходит нарушение

липидных бислоев клеточных и субклеточных мембран. Накопление в крови

первичных и вторичных продуктов ПОЛ идет не в силу количественных изменений

в содержании фосфолипидов плазмы крови, а вследствие интенсификации их

свободнорадикального окисления. Результатом инициации ПОЛ становится

образование критических концентраций продуктов ПОЛ, которые токсичны для

организма. Известно, что повышение ПОЛ может приводить к нарушению

проницаемости мембран с последующей инактивацией мембранно-ассоциированных

ферментных систем, выходом лизосомальных гидролаз в цитозоль, что вызывает

повреждение ДНК т другие существенные изменения в структуре и

функциональном состоянии клетки [29, 43, 51, 52].

Установлено, что при ряде инфекционных заболеваний развивается

антиоксидантная недостаточность. Одновременно снижается актиность ферментов

антиоксидантной защиты, в частности каталазы [44].

По нашим наблюдениям, активность каталазы снизилась на 22 % в острый

период заболевания по отношению к контролю. В период ранней

реконвалесценции показатель активности каталазы приближается к контролю

(табл. 3.2.1).

Л.Б. Оконенко, Л.И. Волкова в своих работах отмечает угнетение

каталазной активности. В острый период заболевания происходит резкое

сокращение антиоксидантной обеспеченности организма [26, 29].

А.С. Волков указывает на то, что в процессе эндотоксикации

метаболические расстройства приводят к гиперлипидемии. Это подтверждается

данными наших наблюдений. Так, уровень холестерина в сыворотке крови

больных сальмонеллезом в среднем составил 6,54(0,07 ммоль/л, что на 46,9%

больше контроля (табл. 3.2.1).

Таким образом, гиперхолестеринемия характеризует патологию обмена

липидов и липопротеидов [32,45].

В период ранней реконвалесуценции уровень холестерина приближается к

контролю [рис. 3.2.1].

Процентное соотношение показателей липидного обмена при эндотоксикозе,

вызванном сальмонеллезной инфекцией

Рис. 3.2.1.

Анализируя результаты проведенных исследований, мы установили, что

содержание ЦИК в плазме крови больных сальмонеллезом на 91 % больше, чем в

контроле [рис. 3.2.2]. Полученные данные согласуются с выводами

исследования И.А. Ильинского, Т.В. Лукинской и других. Повышенное

содержание ЦИК говорит о снижении антителообразования в присутствии избытка

антигенов. В подобной ситуации ЦИК индуцирует острое иммунное воспаление,

сопровождающееся повреждением эндотелия сосудов и почечных клубочков,

активацией кининовой системы, что ведет к более серьезным метаболическим

нарушениям [46, 47, 48].

Как правило, повышение уровня ЦИК обнаруживается уже в начальный

период болезни, на этом же уровне содержание их остается и в острую фазу.

Только в стадии реконвалесценции наблюдается понижение показателей [табл.

3.2.1].

Процентное соотношение показателей эндотоксикоза (ЦИК, МСМ) в сыворотке

больных относительно контроля

Рис. 3.2.2.

При воспалении воздействие протеиназ на протеогликановые комплексы

тканей приводит к образованию пула токсических веществ со

среднемолекулярной массой (МСМ).

У обследованных нами больных сальмонеллезом уровень МСМ на 96 % выше

по сравнению с контролем (рис. 3.2.2). По нашим данным содержание МСМ при

Страницы: 1, 2, 3

МЕНЮ

Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации

ИНТЕРЕСНОЕ