Свойства кисломолочных напитков при хранении

1. Область применения

Методические указания предназначены для центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора, других организаций, осуществляющих контроль за качеством продуктов питания и других объектов внешней среды.

2. Сущность метода

Методические указания содержат описание ускоренного метода качественного и количественного обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов в пищевых продуктах и других объектах исследования, основанного на регистрации относительного электрического сопротивления питательной среды, происходящего под влиянием процессов роста и жизнеспособности микроорганизмов.

Одной из основных задач, стоящих перед учреждениями Госсанэпидслужбы России в соответствии с Законом РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", является внедрение современных инструментальных методов оценки опасных и потенциально опасных для человека химических, физических и биологических факторов окружающей природной, производственной и социальной среды как в рамках функции Госсанэпиднадзора, так и в системе обязательной сертификации продукции и услуг по показателям ее безопасности для здоровья человека. Классические методы микробиологических исследований, используемые в практической деятельности бактериологических лабораторий учреждений службы, достаточно длительны, трудоемки и позволяют получать результаты через несколько суток, что значительно снижает оперативность и эффективность госсанэпиднадзора, особенно при проведении исследований скоропортящейся продукции.

Существующие в настоящее время микробиологические автоматизированные системы на основе импедансных технологий позволяют получать быстрые (в течение нескольких часов) и надежные результаты для большого числа одновременно исследуемых образцов. В основе метода импедансной микробиологии лежит измерение изменения электрической проводимости питательной среды под воздействием роста микроорганизмов, что впервые было показано Стюартом в 1898 году. Однако этот метод получил свое развитие лишь в 70-е годы с появлением соответствующего электронного оборудования и компьютерной техники. Импедансная микробиология является непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов путем определения электрического импеданса. Изменение импеданса происходит в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. При этом незаряженные или слабозаряженные составляющие питательной среды превращаются в сильнозаряженные конечные продукты: белки метаболизируются до аминокислот, углеводы и жиры до органических кислот. Эти электрохимические изменения приводят к существенным изменениям импеданса, экспоненциальные изменения сигнала могут наблюдаться, когда количество микробных клеток достигает порога 106 - 107 клеток/мл. Время, необходимое для достижения значимого изменения импеданса, называется временем определения импеданса (IDT), значение которого обратно пропорционально начальной концентрации микроорганизмов в пробе.

Среди разработанных и применяющихся в настоящее время исследовательских микробиологических систем, предназначенных для ускоренного обнаружения микроорганизмов на основе импедансных технологий, наибольшее распространение получил микробиологический анализатор "Бак Трак 4100" производства австрийской фирмы "SY- LAB". "Бак Трак 4100" является автоматизированной системой для ускоренной (в течение 6 - 8 часов) количественной и качественной оценки степени микробного загрязнения продуктов питания, питьевой воды, напитков, парфюмерно-косметической продукции, контроля за стерильностью различных материалов и растворов.

Прибор автоматически определяет основные санитарно-значимые показатели - мезофильные аэробы и факультативные анаэробы, бактерии группы кишечных палочек (колиформы), патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы и листерии), сульфитредуцирующие клостридии, лактобациллы, энтерококки, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, а также дрожжи и плесени. Кроме того, прибор позволяет также определять наличие ингибиторных веществ в различных продуктах и пищевом сырье. Главным преимуществом микробиологического анализатора "Бак Трак 4100" по сравнению с аналогичными приборами других фирм (благодаря наличию двух пар электродов в измерительных ячейках) является одновременная регистрация двух параметров: М-параметр - относительное изменение полного электрического импеданса (сопротивление + емкость) питательной среды и Е-параметр - относительное изменение импеданса в зоне двойного электрического слоя между электродами. Оба электрических параметра показывают высокую степень корреляции с кривой роста, однако сдвиги в концентрации ионов, происходящие в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, сильнее влияют на Е-параметр, чем на М-параметр, который описывает весь объем образца. В системе "Бак Трак 4100" для обнаружения микроорганизмов, вызывающих незначительные изменения проводимости питательной среды (дрожжи и плесени), используется метод "непрямого импеданса". Сущность метода заключается в регистрации СО , образующегося в 2 процессе метаболизма микроорганизмов, в присутствии щелочи:

СО = 2ОН -> СО + Н О.

Наиболее существенным преимуществом метода "непрямого импеданса" является его большая чувствительность. Так, методом "непрямого импеданса" возможно определять 10 - 10 клеток дрожжей в мл, что на порядок ниже по сравнению с прямым. Таким образом, измерительная система прибора "Бак Трак 4100" реализует принцип разделения импедансного сигнала, регистрируя одновременно как импеданс среды, так и электродный импеданс, а также позволяет проводить измерения прямым и "непрямым методом", что делает возможным использование любых (в том числе и отечественных) питательных сред для проведения исследований.

3. Методики определения санитарно-показательных, потенциально патогенных и патогенных микроорганизмов

3.1. Определение мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов

1. Среда BiMedia 001A (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Дать среде BiMedia 001А уравновеситься при комнатной температуре в течение 6 ч.

2.2. Установить температуру 30 -С на приборе "Bac Trac".

2.3. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч.

Пороговые значения (Thresholds): выбирается соответствующий калибровочный файл для данного вида продукции и параметры пороговых значений вносятся автоматически.

Учет результатов проводится по М-параметру.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 001A.

4. Внести 1 мл предварительно подготовленного в соответствии с требованиями нормативной документации исследуемого образца продукта в измерительную ячейку с 9 мл среды.

5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 001А (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Вас Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически. При пересечении порогового значения происходит автоматический подсчет численности микроорганизмов в исследуемом образце.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Результат определения КОЕ (CFU) выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в 1 мл исследуемого продукта. Если исследуется твердый продукт, то результат определения КОЕ (CFU) необходимо умножить на степень разведения (х 10) для получения КОЕ в 1 г продукта. Примечание. Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в гл. 4 данных Указаний.

3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек - БГКП (колиформ)

1. Среда BiMedia 160B (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 10%

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени

(Time limit 1) 12 ч

Пороговое значение по времени

(Time limit 2) 18 ч.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 160B.

4. Добавить исследуемый образец из соответствующего разведения продукта, в котором не допускается наличие БГКП.

4.1. Если наличие БГКП не допускается в 0,01 г продукта, то для исследования берется 1 мл из разведения 1:100.

4.2. Если наличие БГКП не допускается в 0,1 г продукта, то для исследования берется 1 мл из разведения 1:10.

4.3. Если наличие БГКП не допускается в 1 г продукта, то для исследования берется 5 мл из разведения 1:5 и добавляется к 5 мл среды 160В двойной концентрации.

Возможен также альтернативный вариант при использовании измерительных ячеек на 100 мл.

4.4. Если наличие БГКП не допускается в 1 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:10 и добавляется к 90 мл среды BiMedia 160B.

4.5. Если наличие БГКП не допускается в 10 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:1 и добавляется по 5 мл гомогената в две измерительные ячейки к 5 мл среды 160В двойной концентрации.

Возможен также альтернативный вариант при использовании измерительных ячеек на 100 мл.

4.6. Если наличие БГКП не допускается в 10 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:5 и добавляется к 50 мл среды BiMedia 160B двойной концентрации.

5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 160B (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Исследуемое количество продукта содержит единичные клетки БГКП, и проба считается контаминированной колиформами, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%- ное пороговое значение по Е-параметру в течение 12 ч. При положительном результате наблюдается изменение цвета питательной среды (исходный пурпурный цвет среды меняется на желтый). Дополнение. Если клетки БГКП находились в стрессовом состоянии (термическая обработка, замораживание, высушивание и т.п.), то может наблюдаться более медленный рост культуры с увеличением времени определения по М-параметру до 18 ч. В этом случае проба считается контаминированной, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%- ное пороговое значение по Е-параметру в течение 18 ч.

3.3. Определение сальмонелл

Определение сальмонелл возможно проводить либо на среде BiMedia 201B, либо на среде BiMedia 205A.

3.3.1. Определение сальмонелл на среде BiMedia 201B.

1. Среда: BiMedia 201B (Rappaport-Vassiliadis) (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Предварительное обогащение.

Смешать необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие сальмонелл, со стерильной 1%-ной пептонной водой или средой Pre-Media 205А в соотношении 1:10.

Тщательно перемешать. Инкубировать в течение 14 - 16 ч при 37 -С.

Период предварительной инкубации для мясных, рыбных и молочных продуктов составляет 7 - 8 ч при 37 -С.

3. Протокол измерения.

3.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

3.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 80%

Е-параметр 0 - 80%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 15%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 12 ч 30 мин.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 201B.

5. Внести 0,1 мл предобогащенного образца в ячейку; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с

10 мл среды BiMedia 201B (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac". Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор.

Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен сальмонеллами, если изменение импеданса по Е-параметру превышает 15%-ное пороговое значение в течение 12 ч 30 мин.

9. Подтверждение Salmonella-позитивных образцов. В случае положительного ответа на сальмонеллы проводитсяподтверждение с высевом на селективные питательные среды в соответствии с нормативными документами. Высев производится непосредственно из измерительной ячейки.

3.3.2. Определение сальмонелл на среде BiMedia 205A.

1. Среда BiMedia 205A (Selenite-Cystine media) (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Предварительное обогащение. Смешать необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие сальмонелл, со стерильной 1%-ной пептонной водой или средой Pre-Media 205A в соотношении 1:10. Тщательно перемешать. Инкубировать в течение 16 - 18 ч при 37 -С.

3. Протокол измерения.

3.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

3.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 30%

Е-параметр 0 - 30%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

Е-параметр 10%

М-параметр 5%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Time limit (пороговое значение по времени) 23 ч.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 205A.

5. Добавить 0,1 мл предобогащенного образца в ячейку; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 205A (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор.

Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен сальмонеллами, если изменение импеданса превышает 10%-ное пороговое значение по Е-параметру и 5%-ное пороговое значение по М-параметру в течение 23 ч.

9. Подтверждение Salmonella-позитивных образцов. В случае положительного ответа на сальмонеллы проводится подтверждение с высевом на селективные питательные среды в соответствии с нормативными документами. Высев производится непосредственно из измерительной ячейки.

3.4. Определение энтерококков

1. Среда BiMedia 301А (готовится в соответствии с инструкцией -см. гл. 10).

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 50%

Е-параметр 0 - 50%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 10%.

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 23 ч.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 301А.

4. Добавить исследуемый образец из соответствующего разведения продукта, в котором не допускается наличие энтерококков.

5. Тщательно перемещать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 301А (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен энтерококками, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 ч.

3.5. Определение Staphylococcus aureus

1. Среда BiMedia (Pre-Media 350A и BiMedia 350A) (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Приготовление образца.

Смешать 10 г продукта со стерильной водой в соотношении 1:10, затем тщательно гомогенизировать образец.

3. Предварительное обогащение.

Добавить необходимое количество суспензии продукта, в котором регламентируется отсутствие Staphylococcus aureus (например, 10 мл суспензии, если Staphylococcus aureus определяется в 1 г продукта, и 1 мл суспензии, если Staphylococcus aureus определяется в 0,1 г продукта, к 90 мл или 9 мл среды Pre-Media 350А соответственно).

Инкубировать образец 24 ч.

4. Протокол измерения.

4.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

4.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 30%

Е-параметр 0 - 30%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

Е-параметр 10%

М-параметр 5%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 23 ч.

5. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 350A.

6. Добавить 0,1 мл предобогащенного образца в ячейку; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

7. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 350A (без инокулята).

8. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

9. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".

Примечание.

Время между внесением предобогащенных образцов в ячейки и загрузкой измерительных ячеек в инкубаторный блок не должно превышать 15 мин. В случае превышения данного интервала времени могут быть получены ложные результаты!

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Образец загрязнен Staphylococcus aureus, если изменение импеданса превышает 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 ч.

10. Подтверждение Staphylococcus aureus - позитивных образцов. В случае положительного ответа на Staphylococcus aureus проводится подтверждение в соответствии с нормативными документами (постановка коагулазного, каталазного тестов и теста гемагглютинации). Материал берется непосредственно из измерительной ячейки.

3.6. Определение листерий

1. Среда Pre-Media 403А и BiMedia 403А (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).

2. Предварительное обогащение.

Для предварительного обогащения используется среда Pre-Media 403А.

Смешать необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие листерий, со средой Pre-Media 403А в соотношении 1:10, затем гомогенизировать образец.

Инкубировать образец со средой Pre-Media 403А в течение 24 ч.

3. Протокол измерения.

3.1. Дать среде BiMedia 403А уравновеситься при комнатной температуре в течение 12 ч.

3.2. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".

3.3. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) 36 ч

Масштаб измерений (Scale):

М-параметр 0 - 20%

Е-параметр 0 - 80%

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

М-параметр 5%

Е-параметр 15%.

Проводить учет результатов по Е-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) 30 ч.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 403А.

5. Добавить в ячейку 0,1 мл предобогащенного образца; тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 403А (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5