Микробная утилизация полиароматических углеводородов

Микробная утилизация полиароматических углеводородов

1.Реферат

Работа посвящена актуальной проблеме современной экологической биотехнологии - микробной утилизации полиароматических углеводородов (ПАУ). В рамках работы проведены: поиск и селекция штаммов ПАУ- резистентных грибов, подбор питательных сред и адаптация к ним отобранных штаммов, исследованы процессы деструкции смеси ПАУ грибами Trichoderma linorum и
Phanerochaete chrysosporium, а также процесс фотолиза смеси ПАУ.
Предложена модификация среды Ван-Итерсона для выделения и селекции грибов-деструкторов целлюлозы, резистентных к ПАУ.

2.Содержание

3.Введение..........................................................
...............................................................
3.1.Актуальность проблемы............................................................
...............................
3.2.Состояние разработки проблемы............................................................
.................
3.3.Научная новизна работы..............................................................
..............................

4.Аналитический обзор...............................................................
.....................................
4.1.Вредные ароматические вещества-аналоги компонентов древесины...........................................................
........................................
4.1.1.Химический состав и структура древесины.........................................................
4.1.1.1.Целлюлоза...................................................
...........................................................
4.1.1.2.Лигнин......................................................
...............................................................
4.1.1.3.Экстрактивные вещества............................................................
..........................
4.1.2.Карбонизация древесины. Процессы образования конденсированных ароматических систем..............................................................
........
4.1.3.Полиароматические соединения каменноугольной смолы.................................
4.2.Лигнин и ПАУ-разрушающие микроорганизмы......................................................
.
4.2.1.Воздействие грибов белой гнили...............................................................
.............
4.2.2.Воздействие грибов мягкой гнили...............................................................
...........
4.2.3.Действие бактерий............................................................
.........................................

5.Цели и задачи исследования........................................................
..................................

6.Патентный поиск...............................................................
................................................

7.Экспериментальная часть...............................................................
..................................
7.1.Материалы и методы..............................................................
........................................
7.1.1.Материалы.....................................................
...............................................................
7.1.1.1.Штаммы микроорганизмов.....................................................
...............................
7.1.1.2.Питательные среды...............................................................
..................................
7.1.1.3.Субстраты...................................................
..............................................................
7.1.1.4.Пробы.......................................................
.................................................................
7.1.2.Методы........................................................
.................................................................
7.1.2.1.Выделение культур микромицетов........................................................
...............
7.1.2.2.Изучение морфологических и физиолого- биохимических свойств микромицетов........................................................
....................
7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов
ПАУ.................................................................
...
7.1.2.4.Твердофазное культивирование микроорганизмов............................................
7.1.2.5.Фотолитическая обработка субстратов..........................................................
.....
7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой фазе................................................................
........
7.2.Результаты и обсуждение..........................................................
...................................
7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов
ПАУ.....................................
7.2.2.Микробная деструкция смеси
ПАУ.................................................................
.........
7.2.3.Применение облучения ( (=257,3 нм ) для предобработки
ПАУ-содержащих субстратов..........................................................
...................................
7.2.4.Происхождение микроорганизмов-деструкторов
ПАУ........................................
7.2.5.Анализ возможности создания систем по утилизации твердых ПАУ-содержащих отходов.............................................................
......................

8.Стандартизация....................................................
................................................................

9.Охрана труда и окружающей среды...............................................................
..................
9.1.Характеристика опасных и вредных производственных факторов..........................
9.2.Пожаробезопасность..............................................
........................................................
9.3.Санитария и гигиена.............................................................
.............................................
9.4.Безопасная работа в лаборатории.........................................................
.........................
9.5.Меры первой помощи при несчастных случаях в лаборатории................................
9.6.Охрана окружающей среды...............................................................
.............................

10.Технико-экономическая оценка результатов исследования......................................
10.1.Анализ возможности реализации результатов исследования..................................
10.1.1.Сегментация рынка...............................................................
......................................
10.1.2.Позиционирование товара..............................................................
...........................
10.2.Расчет затрат на проведение исследовательской работы.......................................
10.2.1.Расчет текущих затрат..............................................................
.................................
10.2.2.Расчет затрат на проведение дополнительных работ............................................

11.Выводы и предложения.........................................................
..........................................

12.Список использованной литературы..........................................................
............

3.Введение

3.1.Актуальность проблемы

Интенсивное развитие химической и обрабатывающей промышленности привело к интенсивному накоплению в природных биоценозах значительных количеств токсичных веществ, что, в свою очередь, обусловило развитие исследований в области охраны окружающей среды. Ведущее значение в изучении проблемы экологической безопасности играет биотехнология, так как все основные реакции детоксикации или частичной химической модификации токсичного субстрата связаны с метаболической активностью микроорганизмов.

Вместе с тем, в решении экологических проблем до последнего времени (5-7 лет назад) доминировало традиционное направление- мониторинг объектов окружающей среды и определение ПДК экотоксикантов. Сегодня ведутся работы по использованию штаммов- деструкторов экотоксикантов в очистных сооружениях /1/, но вопросы биодеградации токсичных веществ непосредственно в природных биоценозах (биоремедиации) и создания промышленных технологий, позволяющих очищать природные ландшафты от техногенных загрязнений разработаны недостаточно.

Среди веществ-экотоксикантов полиароматические соединения занимают одно из первых мест по урону, наносимому окружающей среде.
Спектр этих веществ чрезвычайно разнообразен. Их утилизация сводится в основном к захоронению на специальных полигонах.
Токсичность, канцерогенность и мутагенность этих веществ общеизвестна /2/.

Все эти вещества имеют в своей структуре бензольное кольцо, которое содержится в природном полимере лигнине, являющимся, наряду с целлюлозой, одним из основных компонентов древесины. Показано
/3/, что почвенные микроорганизмы способны разрушать лигнин и размыкать, входящее в его структуру, бензольное кольцо. Вполне возможно, что некоторые из этих микроорганизмов, в процессе селекции могут приобрести способность утилизировать ПАУ качестве косубстратов или единственных источников углерода и энергии.

В этой связи представляется перспективной селекция древоразрушающих микроорганизмов в направлении создания штаммов- деструкторов ароматических экотоксикантов, способных разрушать эти вещества в природных биоценозах и промышленных очистных сооружениях.

3.2.Состояние разработки проблемы

В России и СНГ: В России и СНГ (в основном на Украине) активно ведутся работы по поиску штаммов-деструкторов отходов коксохимической промышленности /4/. Изучаются молекулярно- биологические аспекты деструкции ПАУ. Следует отметить, что большинство работ выполнено с использованием бактерий рода
Pseudomonas. Сведений об использовании грибов в процессах детоксикации в отечественной литературе очень мало. Процессам биоремедиации техногенно загрязненных территорий так же не уделяется должного внимания (из за мягкого экологического законодательства).

В других странах: Анализ доступной литературы показал, что в
США и Европе (особенно в ФРГ) ведутся многочисленные исследования по биодеградации полиароматических экотоксикантов непосредственно в природных биоценозах. /5-7/. Можно выделить следующие подходы к решению проблемы, в свете которых ведутся разработки:

1.В почву единовременно или через определенные интервалы вносится суспензия микроорганизмов, которые разлагают вещества- загрязнители.

2.В почву вносится специальная питательная среда, содержащая азот, фосфор, микроэлементы и стимуляторы роста микроорганизмов. В состав смеси входят добавки, способствующие солюбилизации гидрофобных соединений. При использовании таких сред почвенная микрофлора разлагает экотоксиканты значительно быстрее.
Исследователи ФРГ активно разработывают это направление /8/.

3.Совместно используются питательные среды и микроорганизмы и/или производится предобработка субстрата. Американские ученые показали эффективность предобработки экотоксикантов УФ-светом с последующей их утилизацией грибом Phanerochaete chrysosporium и запатентовали данный процесс /9/.

В США и странах Европы исследованы процессы разрушения таких конденсированных систем как нафталин, антрацен, фенантрен, пирен и др./10,11/. Исследованы генетические аспекты деградации ароматических экотоксикантов /12,13/. Однако исследования носят узко специализированный характер-изучаются процессы деструкции одного вещества (в случае смеси исследуется лишь суммарное содержание веществ либо число компонентов, не превышающее 3-5).
Данные по процессам, идущим при биодеградации и фотолизе многокомпонентных (более 10-ти веществ) смесей полиароматических углеводородов отсутствуют как в отечественной так и зарубежной литературе.

Резюмируя вышеперечисленное можно сказать, что сегодня в
России и развитых зарубежных странах ведутся интенсивные исследования в области биодеградации техногенных загрязнителей биоценозов, причем основная роль в процессах детоксикации отводится грибам белой гнили (особенно Phanerochaete chrysosporium) и бактериям рода Pseudomonas. Сведения об использовании для деструкции полиароматических веществ грибов не относящихся к базидиомицетам носят отрывочный характер /14/. Сведений о процессах происходящих при деструкции многокомпонентных смесей экотоксикантов
(10 и более компонентов) в доступной литературе не оказалось.

3.3.Научная новизна работы

Предложена модифицированная среда Ван-Итерсона для выделения и селекции ПАУ-резистентных грибных культур; впервые изучен процесс деструкции смеси ПАУ, состоящей из 16-ти веществ грибами
Trichoderma lignorum и Phanerochaete chrysosporium. Изучен процесс фотолиза смеси ПАУ состоящей из 16-ти веществ.

4.Аналитический обзор

4.1.ПАУ-производные компонентов древесины

4.1.1.Химический состав и структура древесины

4.1.1.1.Целлюлоза

Основным компонентом древесины является целлюлоза, ее содержание в древесине различных пород варьируется от 34,2%
(Chlorophora excelsa Benth. et Hock.f.) до 61,6% (Pinus strobus
L.), в среднем на ее долю в растительных тканях приходится 30-50% сухого вещества. Кроме целлюлозы, древесина содержит ряд других полисахаридов: гемицеллюлозу, крахмал, пектиновые вещества, а также различные органические соединения, такие как лигнин, воска, танин, смолы и т.д. /15/.

Растительные ткани древесины представляют собой сочетание клеток разнообразной формы, имеющих сложное строение целлюлозной стенки, состоящей из 3-х слоев /16/. Первичные клеточные стенки соседних клеток соединены между собой когезивным межклеточным веществом-срединной пластинкой. В период роста срединная пластинка на 2/3 состоит из пектиновых веществ, затем происходит ее лигнификация /17/.

Вторичная клеточная стенка наиболее утолщена и образует большую часть клеточной стенки. Она состоит главным образом из целлюлозы и представляет собой множество концентричных слоев параллельно расположенных вдоль оси микрофибрилл целлюлозы.
Вторичный слой определяет форму клетки и ее механические свойства
/18/. Толщина третичной стенки достигает 70-80 нм. Из-за высокого содержания лигнина она прочна и химически устойчива /19/.

По современным данным макромолекула целлюлозы-это линейный полимер (-D глюкопиранозы с (-1,4-гликозидными связями между мономерами.
Макромолекула целлюлозы представляет собой стереорегулярный высокоориентированный кристаллический полимер с различной степенью полимеризации (степень полимеризации равна числу глюкозных остатков). Степень полимеризации варьируется в зависимости от происхождения: от 15 до 14000 .Так, для целлюлозных волокон хлопчатника, степень полимеризации равна 13000...14000, для древесной целлюлозы-8000 /20/ .Химический состав целлюлозы соответствует формуле (С6 Н10 О5)n. Элементарным звеном макромолекулы является ангидроцеллобиоза, являющаяся основным продуктом расщепления целлюлозы микробными ферментами /21/.
Олигосахариды- продукты ферментативного гидролиза-(ди, три, тетрамеры D-глюкозы) растворимы в воде. Однако сама целлюлоза не растворяется в простых растворителях. Ее можно растворить либо в комплексных растворителях на основе солей металлов (реактив
Швейцера), либо в неводных смесях органических веществ. Можно так же получить растворы целлюлозы, переведя ее в сложный (нитрат, ацетат) или простой эфир. Однако получить растворы целлюлозы, где молекулы были бы полностью разделены очень трудно. Так молекулы нитрата целлюлозы (степень полимеризации 6000), благодаря водородным связям, образуют сетку даже при концентрации их в растворе всего 0,1% /22/. Наличие водородных связей обуславливает также важные свойства целлюлозы, такие как гигроскопичность, скорость растворения, реакционную способность.

В строение древесины, в обеспечение ее механической прочности и взаимодействии с микробными ферментами важную роль играют участки целлюлозы с высокой степенью упорядоченности фибрилл-такие участки получили название кристаллические, в отличие от аморфных участков с беспорядочной ориентацией. Аморфная целлюлоза, в силу менее плотной
,чем у кристаллической целлюлозы, упаковки фибрилл более доступна для химических воздействий и микробных ферментов.

Надмолекулярная структура целлюлозы представлена элементарными фибриллами или мицеллами, диаметр которых составляет
10нм. Мицеллы. в свою очередь, объединяются в микрофибриллы диаметром 25 нм. Последние формируют целлюлозные волокна. Плотно упакованные фибриллы образуют подобие кристаллической решетки, обеспечивая прочность растительной клетки, взаимодействие с аморфным матриксом, содержащим другие полисахариды и органические вещества.

4.1.1.2.Лигнин

Наряду с целлюлозой, важным компонентом растительной ткани является лигнин. Лигнин- один из самых устойчивых и широко распространенных органических полимеров в природе. Он накапливается в клеточной стенке и в промежутках между целлюлозными волокнами, что придает древесине дополнительную прочность и устойчивость к химическим воздействиям.

В состав древесины входит от 17,6% ( Populus tremuloides
Michx. ) до 39,8% ( Lophira alata Bauks. ex Gaertu.f. ) лигнина
/15/. Содержание лигнина в различных тканях растений различно и варьируется от 5% до 30% /23/.

Лигнин- сложный трехмерный полимер фенольной природы, в котором оксифенилпропановые мономеры соединены между собой эфирными и С-С связями /24/. Роль мономеров играют различные оксифенилпропановые спирты: конифериловый ( в древесине хвойных деревьев), синановый (в древесине лиственных растений) и n- кумаровый (в травянистых растениях) /Рис.1./.

[pic][pic] [pic]

Рис.1.

Структуру лигнина, в отличии от целлюлозы, нельзя описать простой комбинацией одной или нескольких мономерных единиц с одним типом связи. В связи с этим структура лигнина является предметом моделирования. Последняя модель, построенная на основе информации полученной при изучении соснового (Pinus taeda) лигнина, включает
94 единицы (общая молекулярная масса более 17000) / 15 /. В лигнине можно насчитать двенадцать типов связей, причем более 50% из них это (-(-4 и (-(-4 связи /24/. В настоящее время общепринята концепция которая утверждает, что структура лигнина является результатом случайного сочетания его предшественников. Наряду с этой концепцией существуют гипотезы упорядоченного строения лигнина, однако экспериментальные факты свидетельствуют в пользу представлений о неупорядоченном строении макромолекулы лигнина.

Важной способностью лигнина является его способность образовывать тесную ассоциацию с полисахаридными частями клеточной стенки- лигноцеллюлозные или лигноуглеводные комплексы, в формировании которых главную роль выполняют ковалентные связи.
Считается, что с лигнином химически связаны полиозы, хотя связь с целлюлозой полностью не исключаентся. Фрагменты полиоз в лигноуглеводных комплексах представлены остатками ксилана и маннана. Из древесины лиственных пород выделяли лигнин-ксилановые комплексы /25,26/, а из древесины хвойных-лигнин-маннановые и лигнин-ксилановые /27-31/.

На электронных микрофотографиях елового лигнин-полиозного комплекса видно, что полиозы внедрены в лигнин, а так же сильно закручены и перевиты вместе с ним. Чаще всего с лигнином связаны боковые ответвления полиоз- звенья арабинозы, галактозы и 4-О- метилглюкуроновой кислоты. Показано, что лигноуглеводные комплексы богаты именно этими сахарами /28,32/.

При воздействии микроорганизмов на древесину лигнин, ассоциированный с полисахаридами клеточной стенки, является основным препятствием для действия микробных ферментов на целлюлозу растительных тканей.

4.1.1.3.Экстрактивные вещества

Экстрактивные вещества играют огромную роль в жизни дерева и обуславливают многие свойства древесины (цвет, запах, резистентность к фитопатогенам и т.д.). При нормальных условиях доля этих веществ составляет в среднем не более 5%, причем у различных видов их содержание неодинаково, так например в древесине
Pinus abies содержится 2,22%, а в древесине Populus tremula -
4,53%. Искусственно содержание экстрактивных веществ в сосне различных видов может доводиться до 15%. При обработке дерева перед рубкой гербицидом паракваном или подобными соединениями в стволе появляются зоны, пропитанные смолой (стволовой осмол)/15/.

Химический состав экстрактивных веществ чрезвычайно разнообразен, однако в свете данной работы нас интересуют лишь их ароматическая фракция.

Ароматические терпены. Содержание ароматических терпенов в древесине хвойных пород ничтожно и единственным примером соединений такого рода является представитель класса монотерпенов (-цимол
(рис.2.).

Рис.2.

Лиственные породы богаче ароматическими терпенами: в древесине видов Ulmus, Celtis и Zelkowa найдены 5 видов ароматических сесквитерпенов, среди которых наиболее интересны лацинилен А и 7- гидроксикадаленаль, содержащие нафталиновое ядро (с.рис.2.)

Простые фенолы. Среди простых фенолов, выделенных их экстрактивных веществ ели (Picea abies), присутствуют ванилин, n- гидрокси-бензойальдегид, конифериловый альдегид, гваяцилглицерин, n- этилфенол, кониферил и сирингин, а так же крезол и другие фенолы.
Некоторые простые фенолы были выделены из древесины сосны (виды
Pinus). Из древесины лиственных пород Populus и Salix выделили n- гидроксибензойную, ванилиновую, сиреневую, феруловую кислоты, ванилин, сиреневый альдегид.

В экстрактах древесины Quercus alba обнаружили ряд фенолов, среди которых присувствовали синаповый, конифериловый, сиреневый альдегиды, ванилин, пропионгваякол и n-гидроксибензальдегид. В древесине дуба найдены фенол, крезолы, гваякол, n-этилфенол, эвгенол и другие фенольные соединения.

Лигнаны. Лигнаны-соединения, состоящие из двух фенилпропановых единиц, соединенных различными способами. Некоторые из этих соединений аналогичны димерным структурам, присутствующим в макромолекуле лигнина. Многие лигнаны, найденные в экстрактах древесины видов Picea, Pinus, Larix и Tusida содержат цикл тетрагидрофурана, например пинорезинол, лариццирезинол, конидендрин и лиовил. Существуют так же и нециклические структуры с (-( связями между структурными единицами (секоизоларицирезинол) и шестичленные циклы (изоларицирезинол, конидендрин, пликатин). Из древесины Thuja plicata выделен пликатинафтол-лигнан, содержащий нафталиновое ядро(рис.3.)/15/.

Страницы: 1, 2, 3, 4