Микробная утилизация полиароматических углеводородов

p> Рис.3.

4.1.2.Карбонизация древесины. Процессы образования конденсированных ароматических систем

После гибели дерева древесина либо разлагается микроорганизмами либо, в некоторых природных условиях превращается в ископаемую древесину.

Различают два типа процесса образования ископаемой древесины: силикатизацию (окаменение) и карбонизацию (углификацию). В свете нашей работы интерес представляют химические процессы, происходящие при карбонизации древесины. Рассмотрим их более подробно.

Химический анализ образцов старой и ископаемой древесины указывает на уменьшение содержание полисахаридов и возрастание количества негидролизуемого остатка по мере увеличения возраста и степени деградации. У относительно молодых, но сильно деградированных образцов обнаружили присутствие микроорганизмов.

Из результатов исследований древних образцов дуба, а также образцов березы, ясеня и сосны видно, что на степень деградации влияют окружающие условия, особенно на ранних стадиях. Некоторые старые образцы (возрастом 8500 лет) содержали больше полиоз, чем молодые (возрастом 900 лет).

По увеличению относительного содержания целлюлозы в образцах деградированной древесины видно, что превращения начинаются с полиоз. Быстрее разрушаются легкорастворимые полиозы, в частности пентозаны, чем труднорастворимые. Массовая доля полиоз, растворимых в 5%-ным КОН в ядровой древесине современного образца дуба
,составила 22,4%, а в образце возрастом 8500 лет снизилась до
12,4%,тогда как массовая доля полиоз ,растворимых в 24%-ном КОН, снизилась с 6,1% только до 5,4% /15/.

Деградация полисахаридов начинается на ранних стадиях процесса, однако некоторая часть полисахаридов может сохраняться многие миллионы лет. В образце древесины хвойной породы возрастом
100 млн. лет нашли около 2% сахаров. Из образца древесины из нижнего мелового периода (140 млн. лет назад) выделили 1,1% холоцеллюлозы, в гидролизате которой основными сахарами были глюкоза и манноза. В образце ископаемой древесины семейства
Protopinaceae, очевидно, еще сохранились небольшие количества целлюлозы и полиоз даже после 180 млн. лет, так как гидролизаты содержали глюкозу, маннозу и ксилозу.

Лигнин способен сохраняться в течении миллионов лет, но в то же время он может претерпевать изменения даже и за относительно короткие промежутки времени. В молекулах лигнина образцов древесины возрастом 900-4400 лет обнаружили окислительные превращения.
Окисление лигнина было замечено также в образцах древесины возрастом 30 млн. лет. Лигнин может терять 2/3 метоксильных групп.
ИК-спектры образцов древесины указывают на присутствие конденсированных колец, образовавшихся главным образом из лигнина.
С увеличением возраста превращение лигнина в конденсированные ароматические системы усиливается. Битуминозный уголь имеет высокое содержание таких систем. Конденсация ароматических колец служит причиной увеличения содержания углерода в процессе карбонизации. В конце этого процесса получается графит. Ароматические кольца могут возникать и из продуктов деградации полисахаридов. Известно, что пировиноградный альдегид может легко ароматизироваться через хиноны
/33/.

В настоящее время каменный уголь является основным источником
ПАУ для промышленности. Таким образом, ПАУ, выбрасываемые промышленностью в биосферу, являются производными древесины древних сосудистых растений.

4.1.3.Полиароматические соединения каменноугольной смолы

Каменноугольная смола (креозот) образуется при коксовании каменного угля и является основным источником ПАУ для химической промышленности. Именно креозот является основным источником ПАУ- экотоксикантов.

В составе каменноугольной смолы нами были обнаружены 16 ПАУ, а именно: нафталин, аценафтен, аценафтилен, флуорен, фенантрен, антрацен, флуорантен, пирен, бензантрацен, хризен, бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуорантен, бенз[а]пирен, дибензантрацен, бензперилен, инденопирен (Рис.4.). Больше всего в креозоте содержится фенантрена и флуорантена. Суммарно эти вещества составляют 64% фракции ПАУ. Другие вещества, такие как бенз[а]пирен, хотя и составляют 0,7% фракции ПАУ являются сильнейшими канцерогенами.

Химически эти вещества представляют собой многоядерные ПАУ.
Содержание нафталина в смеси очень низко. Основная масса ПАУ- трех-
, четырех- и более ядерных соединения.

Рис.4.ПАУ каменноугольной смолы

4.2.Лигнин и ПАУ-разрушающие микроорганизмы

Как было отмечено выше, естественным резервуаром микроорганизмов-деструкторов ПАУ являются почва и лесная подстилка.
Фитопатогенные грибы, поражающие древесину, также перспективны в плане отбора ПАУ-разрушающих штаммов.

Грибы, разрушающие древесину, подразделяются на четыре группы:

1.Грибы бурой гнили- принадлежат к подотделу базидиомицетов, разрушают, главным образом, полисахариды древесины.

2.Грибы белой гнили- - принадлежат к подотделу базидиомицетов, разрушают, главным образом, лигнин, однако способны разрушать полисахариды.

3.Грибы мягкой гнили- сумчатые и несовершенные грибы, разрушают полисахариды и лигнин.

4.Грибы синевы- сумчатые и несовершенные грибы, живут, главным образом, за счет остаточных белков паренхимных клетках.
Ограничено разрушают полисахариды.

5.Бактерии- способны разрушать полисахариды и лигнин, однако, их морфологические свойства (колониальный рост) не позволяет им выступать в качестве высоко эффективных деструкторов при твердофазной ферментации.

Таким образом, наиболее перспективными для отбора ПАУ- разрушающих штаммов являются грибы белой и мягкой гнили (базидио- и аскомицеты). Рассмотрим влияние их ферментных систем на природные ароматические вещества.

4.2.1.Воздействие грибов белой гнили

Грибы белой гнили вырабатывают различные ферменты, способствующие усвоению лигнина /34/. Некоторые из грибов дают, преимущественно, лакказу, другие пероксидазу и тирозиназу. Процесс выработки ферментов различен в зависимости от того используется фермент внутри или вне гиф.

У всех видов диких грибов обнаружена комбинированная деструкция всех компонентов древесины. Обнаружен фермент, который нуждается в целлобиозе (продукте разложения целлюлозы) для деструкции лигнина при совместном действии с локказой /15/.Этот фермент был назван целлобиозохиноноксиредуктазой. В дальнейшем было показано, что для разложения лигнина грибом Phanerohaete chrisosporium.(синоним Sporotrichum pulverolentum) наличие целлобиозохиноноксиредуктазы не является необходимым. Наличие же лакказы абсолютно необходимо. Мутант гриба, не вырабатывающий этой фенолоксидазы, не способен разрушать лигнин.

Изменение в лигнине под воздействием грибов белой гнили заключается в увеличение содержания карбонильных и карбоксильных групп. Отношение О/С увеличивается, а Н/С понижается. Увеличение содержания кислорода происходит в результате окисления (-углеродных атомов и окислительной деструкции связей между (- и (-углеродными атомами пропановой цепи. В опытах с меченным (14С) лигнином показано, что при действии грибов белой гнили (Coriolus versicolor,
Phanerohaete chrysosporium) конечный продукт метаболизма СО2 образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец. Далее осуществляется окислительное расщепление (-О-4,(-5, (-1 и (-( связей. При этом получаются мономерные звенья лигнина, которые далее разрушаются посредством раскрытия ароматического кольца.
Однако, ароматические кольца могут расщепляться и в полимере лигнина /15/.

4.2.2.Воздействие грибов мягкой гнили

Грибы мягкой гнили вырабатывают ферменты, разрушающие все компоненты древесины. Деструкция лигнина грибом Chaetomium globosum до общей потери массы древесины 12% заключается в деметилировании.
С увеличением потери массы происходит дальнейшее разложение лигнина. Исследования показали, что при этом не происходит накопление ароматических соединений, следовательно грибы мягкой гнили разрушают ароматические кольца и в самом лигнине и в продуктах.

4.2.3.Действие бактерий

Способность различных бактерий разрушать мономеры и предшественники лигнина показано в опытах с модельными соединениями
/35,36/. Однако, в силу морфологических особенностей бактерии не способны эффективно разлагать его полимерные формы.

Исследования по разрушению ПАУ почвенными бактериями показали, что псевдомонады являются наиболее эффективными деструкторами этих соединений. Исследования показали, что ПАУ эффективно разлагаются псевдомонадами в условиях глубинной и твердофазной ферментации, в ризосфере растений /37/.

Исследования механизмов деструкции ПАУ (фенантрена) культурой
Pseudomonas fluorescens показали /4/, что окисление ПАУ бактериями происходит последовательно, то есть ферментная атака направлена только на одно кольцо(Рис.5.).

Рис.5.Механизм деструкции фенантрена

Способность разрушать природные ароматические вещества натолкнула исследователей на мысль об использовании микроорганизмов для разрушения ароматических и полиароматических веществ- отходов химической индустрии. В 1990 году американские исследователи показали, что разрушающие лигнин грибы белой гнили Phanerohaete chrysosporium способны также разлагать полициклические ароматические углеводороды до СО2 /38/. Была так же показана способность бактериальных штаммов разлагать ПАУ /39/. В настоящее время работы по микробной деструкции ПАУ ведутся, практически, во всех развитых странах. Показано /40/, что деструкция ПАУ идет последовательно и начинается с гидроксилирования только одного ароматического кольца (рис.6.).

Рис.6.Гидроксилирование бензольного кольца. Упрощенная схема микробной деструкции нафталина

Таким образом простые ПАУ должны разлагаться микроорганизмами гораздо быстрее чем такие ПАУ как пирен, хризен, 3,4бензпирен и другие. В соответствии с правилом последовательного окисления только одного ароматического кольца при деструкции смеси ПАУ должно происходить накопление полиядерных веществ, разрушение которых требует длительных сроков инкубации. Правило последовательного окисления действует для различных видов микроорганизмов.

5.Цели и задачи исследования

Целью работы является изучение процессов биодеградации смеси вредных ПАУ микроорганизмами, разрушающими древесину и создание на их основе высокоэффективных штаммов-деструкторов указанных соединений.

Задачи исследования сводятся к:

1)Поиску в коллекциях и выделению из природных биоценозов микроорганизмов-деструкторов вредных веществ и отбор наиболее активных штаммов;

2)Адаптации штаммов к условиям культивирования
(масштабирование процесса);

3)Изучению процессов разрушения многокомпонентной смеси ПАУ в условиях твердофазной ферментации;

4)Изучению фотолиза ПАУ.

6.Патентный поиск

Поиск патентной информации проводился на базе фундаментальной библиотеки СПбГТИ(ТУ), объединенной библиотеки ВИЗР и ВНИИСХМ, библиотеки АН, а также Российской Национальной библиотеки. Поиск осуществлялся по следующим направлениям: штаммы-деструкторы ароматических экотоксикантов, питательные смеси для очистки загрязненных почв, аппаратурное оформление процессов компостирования твердых отходов, методы предобработки отходов. По данным направлениям обнаружена следующая инормация:

1.Штамм актиномицетов Streptomyces rochei, осуществляющий полное разложение 2,4,6-трихлорфенола или 2,4-дихлорфенола или 2,6- дихлорфенола, или 2-хлорфенола: А.с. 1652335 СССР, МКИ5 С12 N 1/20,
С12 S 13/00/ Головлева Л.А., Заборина О.Е., Перцова Р.Н., Евтушенко
Л.И.; Ин-т биохимии и физиол. микроорганизмов АН СССР.- № 4696431;
Заявл. 08.06.89; Опубл. 30.05.91, Бюл. № 20.

2.Методы и установка для [проведения] аэробного ферментативного, в частности, для компостирования органических материалов. Verfahren und Vorrichtung zur aeroben, fermentativen
Hydrolyese, insbesondere zur Kompostierung vor organischen
Stoffen: Заявка 3925905 ФРГ, МКИ5 С12М 1/02, СО5F 9/04/ Hofmann
Hermann, Schnorr Karl Ersnt.-№ 3925905.6; Заявл. 04.08.89; Опубл.
28.02.91.

3.Фотолитически усиленное микробное разрушение [веществ] загрязняющих окружающую среду. Photochemically enhanced microbial degradation of enviromental pollutants: Пат. 5342779 США МКИ5 ВО9В
3/00, D06Н 16/00/ Matsumura Fumio, Katayama Arata; The Regents of the University of California.- №687368; Заявл.18.04.91; Опубл.
30.08.94; НКИ 453/262.5.

4.Улучшенная смесь питательных соединений для биологической очистки загрязненых почв и вод. Verbesserte Nahrstoffgemische fur die Bioremediation verschmutzter Boden und Cewasser: Заявка 4228168
ФРГ, МКИ5 С12N 1/26, С12S 9/00/ Kopp-Holtwiesche Bettinna, Weiss
Albricht; Henkel KGaA.-№ 4228168.7; Заявл. 25.08.92; Опубл.
03.03.94.

5.Штамм бактерий - деструктор фенола, бензола и их галогензамещенных аналогов: Пат. 2041943 Россия, МКИ6 C12N 1/12,
CO2F 3/34/ Зайцев Г.М., Ивойлов В.С; Суровцева Э.Г.; Науч.-произв. предприятие Биотехинвест. - №92014789/13; Заявл. 28.12.92; Опубл.
20.08.95, Бюл. № 23.

7.Экспериментальная часть

7.1.Материалы и методы

7.1.1.Материалы

7.1.1.1.Штаммы микроорганизмов

В нашей работе были использованы штаммы мицеллиальных грибов любезно предоставленные Ю.С.Оследкиным (ВНИИСХМ, г.Пушкин).

В таблице №1 приводится список видов и номера штаммов, а также указывается доступная информация об источнике их происхождения (организации и/или географическом и/или экологическом происхождении).

таблица 1
| | | коллекционный/| |
|№п/.п |название штамма | |источник |
| | |музейный | |
| | |номер штамма | |
|1 |Trichoderma linorum | 32 |ARRIAМ |
|2 |Trichoderma linorum | 37 |ARRIAM |
|3 |Trichoderma linorum | 48 |ARRIAM |
|4 |Chaetomium elatum Kunze:Fris | 341 |СПбГУ |
| |1817 | | |
|5 |Chaetomium bainieri Munk 1957 | 344 |СПбГУ |
|6 |Chaetomium funicolum Cooke 1873 | 347 |СПбГУ |
|7 |Chaetomium coclioides Palliser | 491 |Укр.ИСХМ |
| |1910 | | |
|9 |Coriolus versicolor | 330 |ВИЗР |
| |(L.1753:Fr. 1821) Quelet 1888 | | |
| | | |Ленинград- |
|10 |Fusarium solani (Martius) Sacc |464 |ский рег., |
| |1881 | |почва |
| | | |РФ, |
|11 |Fusarium solani (Martius) Sacc |496 |почва |
| |1881 | | |
|12 |Phanerochaete chrysosporium | F-20696|ATCC |

7.1.1.2.Питательные среды

В работе были использованы следующие питательные среды:

1.Среда Ван-Итерсона /41/, г/л:

NH4NO3 -0,5

KH2PO4 -0,5 полоска фильтровальной бумаги -1x12 см

H2O -1 литр

2.Среда Ван-Итерсона модифицированная /42/: минеральный состав среды тот же, что и в классическом варианте, полоска фильтровальной бумаги инпрегнированна веществом, для которого отбирается штамм-деструктор содержание вещества составляет 5% от массы полоски бумаги

3.Среда Чапека /41/, г:

KH2PO4 -1,0

NaNO3 -3,0

KCl -0,5

MgSO4.7H2O -0,5

FeSO4.7H2O -0,01

H2O -1 литр

4.Среда Чапека с сахарозой/41/:

Минеральный состав без изменений, добалено 30 г/литр сахарозы

5.Сусло пивное неохмеленное /41/:

Неохмеленное пивное сусло разводится в два раза водопроводной водой и стерилизуется

Для получения твердых питательных сред добавляли 2 г/литр агар- агара.

7.1.1.3.Субстраты

7.1.1.4.Пробы

В работе были использованы образцы древесины телеграфных столбов, подвергшихся воздействию микроорганизмов (Новгородский регион), любезно предоставленныe Марьяновской Юлией Валентиновной
(кафедра МБТ СПбГТИ(ТУ)).

7.1.2.Методы

7.1.2.1.Выделение культур микромицетов

Выделение первичных культур велось на модифицированной среде
Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности, гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток.
Остальные условия оговариваются особо.

Выделение чистых культур велось на агаре Чапека с использованием стандартных микробиологических методов /43/.

7.1.2.2.Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств культур микромицетов

Для изучения морфологических, культуральных и физиолого- биохимических свойств культур микромицетов использовали стандартные микробиологические среды и методы /41/.

Цитоморфологические наблюдения проводили с помощью общепринятых методов и растворов красителей /41/.

7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов ПАУ

Отбор целлюлолитических штаммов мицеллиальных грибов оcуществляли на среде Чапека c целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально.

7.1.2.4.Твердофазное культивирование микроорганизмов

Культивирование мицелиальных грибов в твердой фазе проводили в кюветах емкостью 0,5 л и бутылях емкостью 30 л.

Содержание среды в кюветах-250 г, в бутылях-2,5 кг.
Перемешивание осуществляли вручную: в кюветах-шпателем, в бутылях встряхиванием. Периодичность перемешивания и остальные условия оговариваются особо.

Культивирование мицеллиальных грибов проводилось на специально разработанных средах, представляющих собой измельченную древесину, инпрегнированную ароматическими веществами и увлажненную раствором солей и сахаров. Объем увлажняющей жидкости составлял 200-
400 мл на 1 кг древесины.

Посевной материал для кювет выращивали на чашках Петри на тех же средах. Чашки Петри засевали суспензией спор, полученной путем смыва увлажняющей жидкостью с газона 7-суточной культуры на агаре
Чапека. Для засева бутылей использовали содержимое кювет, во всех случаях посевной материал вносился в количестве 10% от объема ферментационной среды.

7.1.2.5.Фотолитическая обработка субстратов

Субстраты помещали в кюветы, которые располагались под источником излучения на расстоянии 50-60 см. Чтобы избежать перегрева поверхности субстрата, лампа работала периодически, не более 4 часов в течении рабочего дня.

В качестве источника излучения использовали газоразрядную лампу ПРК-7 ((max=257,3 нм).

7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой фазе

Экспериментальные образцы подвергались сушке в термостате при
105ОС до постоянного веса.

Экстракцию ПАУ осуществляли в аппарате Сокслета в течении 6 часов. В качестве экстрагента использовали предварительно очищенный от примесей углеводородов гексан.

Полученный экстракт упаривали до небольшого (4-5мл) объема.
Затем в него добавляли около 1г активированного силикагеля
(Silpearl) и упаривали досуха. Далее пробу вносили в разделительную колонку с силикагелем и вымывали посторонние примеси 40мл гексана.
Затем элюировали фракцию ПАУ 120мл смеси гексан:хлористый метилен
(4:1). Фракцию, содержащую ПАУ упаривали до объема 0,25-1,0мл.

Газхроматографический анализ сконцентрированных компонентов проводили на хроматографе ’’Цвет-570М’’ с пламенно-ионизационным детектором на кварцевой капиллярной колонке (30м, 0,25мм) с неподвижной фазой DB-5 при программном повышении температуры от 70 до 320ОС со скоростью 4ОС в минуту. Количественные данные получали методом абсолютной градуировки детектора стандартными растворами
ПАУ (’’Экрос’’, Санкт-Петербург). Градуировку по бенз[а]пирену осуществляли при помощи ГСО 7064-93.

Идентификацию компонентов смеси осуществляли хромато-масс- спектрометрически на приборе LKB-2091 фирмы LKB-BROMMA (Швеция).
Хроматографические условия были те же, что и в случае количественного анализа. Идентификацию проводили путем сравнения масс-спектров электронного удара при помощи компьютерной информационно-логической системы ’’Компас-МС’’.

7.2.Результаты и обсуждение

7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов ПАУ

Микробная деструкция экотоксикантов в последние десятилетия стала объектом интенсивных исследований практически во всех развитых странах мира. Эффективность этого процесса определяется в первую очередь активностью штамма-деструктора экотоксикантов.
Необходимость интенсифицировать процессы биоремедиации побуждает исследователей как к проведению селекции коллекционных штаммов, так и к поиску новых деструкторов /44-46/.

Проведенные эколого-таксономические исследования показали, что представители микрофлоры лесной подстилки (рода Alternaria,
Cladosporium, Helmintosporium-подобные, Chaetomium и др.), а так же почвенной микрофлоры ( рода Aspergillus, Trichoderma, Penicillium и др.) способны разлагать лигниноцеллюлозу и разрушать ароматические ядра лигнина /34/.

Фитопатогенные грибы так же способны разрушать природные аромитические вещества (Fusarium) /34/.

Обычно для выделения штаммов, разлагающих то или иное вещество, используют жидкие или агаризованные среды, содержащие это вещество как единственный источник углерода и энергии. Однако, по нашему мнению, для биоремедиации следует использовать микроорганизмы, сочетающие в геноме способность утилизировать как экотоксикант, так и целлюлозу, которая содержится в почве и является основным компонентом твердых отходов. Мы решили, что наилучшей средой для отбора микромицетов, разрушающих ПАУ в соокислительных условиях будет среда Чапека с целлюлозой и ПАУ. В качестве критерия отбора использовали общепринятый метод оценки роста культур мицеллиальных грибов по характеристике их роста в баллах через определенные, одинаковые для всех штаммов периоды времени. Такая методика позволяет отобрать наиболее резистентные и быстрорастущие штаммы.

Для выделения ПАУ-резистентных целлюлолитиков из природных биоценозов на наш взгляд наиболее подходит среда модифицированная
Ван-Итерсона /42/, где полоска фильтровальной бумаги была инпрегнированна ПАУ. На такой среде селективно отбираются ПАУ- резистентные микроорганизмы. Для отработки методики и с целью поиска штаммов-деструкторов ПАУ нами из техногенных биоценозов был выделены ряд микроорганизмов.

Из биоценоза свалки старых телеграфных столбов было отобрано
5 проб древесины, имеющей ярко выраженные биоповреждения. Пробы помещали в стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками высушивали и хранили при обычных условиях.

Страницы: 1, 2, 3, 4

МЕНЮ

Микробная утилизация полиароматических углеводородов

ИНТЕРЕСНОЕ