Микробная утилизация полиароматических углеводородов

p> Выделение первичной культуры велось на модифицированной среде
Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности, гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток, температура поддерживалась на уровне +25ОС.

Идентификация велась на сусло-агаре и среде Чапека. Было выделено и идентифицировано 5 штаммов: Trichoderma linorum,
Trichoderma sp. и три представителя рода Fusarium. Хранили штаммы на модифицированной среде Ван-Итерсона. Во избежании путаницы штаммам были присвоены музейные номера (см. табл.3. ). таблица 3
|№ | видовое | музейный номер* |
|п.п. |название | |
| |штамма | |
|1 |Trichoderma linorum | |
| | |Н-1 |
|2 |Trichoderma sp. | |
| | |Н-2 |
|3 |Fusarium sp. | |
| | |Н-3 |
|4 |Fusarium sp. | |
| | |Н-4 |
|5 |Fusarium sp. | |
| | |Н-5 |

*Н- Новгородский рег., 1- порядковый № штамма

Для проведения исследований мы использовали культуры, выделенные из техногенных биоценозов, а так же коллекционные, любезно предоставленные Оследкиным Ю.С. (разд. ). Отбор штаммов оcуществляли на среде Чапека с целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально. Результаты представлены в таблице 4.

таблица 4
| | |коллекцион-|колонизация поверхности |
|№ |название | |субстрата, % |
| | |ный/музейны| |
| | |й | |
|п.п.|штамма | номер | время инкубации, |
| | | |сутки |
| | | штамма |3 |6 |9 |12 |15 |20 |
|1 |Trichoderma lignorum | 32 |0 |0 |2 |4 |2 |2 |
|2 |Trichoderma lignorum | 37 |0 |10 |30 |45 |60 |60 |
|3 |Trichoderma lignorum | 48 |0 |0 |10 |10 |10 |10 |
|4 |Trichoderma linorum | Н-1 |0 |0 |10 |15 |15 |20 |
|5 |Trichoderma sp. | Н-2 |0 |5 |10 |10 |10 |10 |
|6 |Chaetomium elatum | 341 |0 |2 |4 |4 |8 |4 |
|7 |Chaetomium bainieri | 344 |2 |2 |2 |4 |2 |2 |
|8 |Chaetomium funicolum | 347 |0 |4 |4 |6 |4 |2 |
|9 |Chaetomium coclioides | 491 |0 |0 |4 |6 |6 |2 |
|10 |Coriolus versicolor | 330 |0 |0 |6 |8 |2 |2 |
|11 |Fusarium solani | 464 |0 |0 |4 |6 |6 |6 |
|12 |Fusarium solani | 496 |0 |0 |2 |2 |2 |2 |
|13 |Fusarium sp. | Н-3 |0 |0 |4 |6 |6 |6 |
|14 |Fusarium sp. | Н-4 |0 |2 |6 |8 |8 |8 |
|15 |Fusarium sp. | Н-5 |0 |0 |6 |6 |6 |6 |

Практически все исследуемые микроорганизмы обладали способностью расти и образовывать колонии на поверхности субстрата.
Однако у большинства культур процент заселения поверхности субстрата был незначителен (до 10%). По-видимому таким культурам требуется более длительный срок адаптации или наличие стимуляторов роста. Наибольшей скоростью роста и высокой степенью колонизации
(до 60% площади субстрата) обладал штамм Trichoderma lignorum №37.
Характер роста данного микроорганизма соответствовал каталожному описанию и заключался на начальных этапах в образовании небольших колоний диаметром 1-1,5 мм, постепенно сливающихся в единое целое и формирующих поверхностный мицелий светло зеленого цвета. Этот штамм и был отобран для дальнейших исследований.

7.2.2.Микробная деструкция смеси ПАУ

Анализ литературных данных показал, что основная масса работ по деструкции ПАУ посвящена изучению деструкции одного вещества или смеси ПАУ/6,11,14/, содержащей не более 5 компонентов. Однако в реальных условиях спектр ПАУ-экотоксикантов гораздо шире. Данные по деструкции многокомпонентных смесей ПАУ в доступной литературе отсутствуют. Между тем изучение процессов деструкции смеси экотоксикантов имеет очень важное значение для разработки процессов биоремедиации.

Для изучения деструкции смеси ПАУ нами в качестве модельного субстрата была выбрана древесина шпал. Использование этого субстрата значительно упрощало работу так как отпадала необходимость работать с креозотом непосредственно.

Для приготовления ферментационной среды субстрат измельчали до фрагментов размером около 5 мм и увлажняли жидкой средой Чапека с сахарозой (см.разд.7.1.). Посевной материал выращивали в чашках
Петри на такой же среде. Объем ферментационной среды составлял
250гр., посевной материал вносился в количестве 10-ти % от объема среды. Температура культивирования составляла 25оС, пробы отбирались на 14-е и 20-е сутки инкубации. Содержание ПАУ в экспериментальных образцах определяли методом хромато-масс- спектроскопии (см.разд.7.1.). Результаты анализа представлены в таблице 5: таблица 5
| | содержание ПАУ в образцах, |
|вещество |мг/кг |
| | контроль| 14 суток | 20 суток |
|Нафталин | 22 | 0,4 | 0,1 |
|Аценафтен | 7 | 2,2 | 0,4 |
|Аценафтилен | 86 | 1,5 | 0,4 |
|Флуорен | 86 | 3,1 | 2,9 |
|Фенантрен | 1840 | 87 | 43 |
|Антрацен | 600 | 24 | 12 |
|Флуорантен | 1430 | 350 | 210 |
|Пирен | 520 | 100 | 71|
|Бензантрацен | 230 | 8 | 2,7|
|Хризен | 160 | 22 | 15|
|Бенз(b)флуоранте| 45 | 12 | 4,3|
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте| 34 | 3,6| 27|
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |35 |5,9 |2,8 |
|Дибензантрацен |18 |2,7 |4,4 |
|Бензперилен |10 |4,7 |21 |
|Инденопирен |9 |3,4 |16 |

Анализ экспериментальных данных по деструкции ПАУ, приведенные в табл.45 показал, что различные по строению ПАУ разрушаются Trichoderma lignorum с различной скоростью. Простые
ПАУ, такие как нафталин, антрацен, фенантрен в большей степени подвержены деструкции, чем многоядерные. Литературные /40/ данные свидетельствуют, что микробная деструкция нафталина ферментами оксигеназами происходит последовательно и начинается с гидроксилирования только одного аромтического кольца (см. рис.6.).

В соответствии с правилом последовательного окисления только одного ароматического кольца сложные 4х-5ти ядерные ПАУ в меньшей степени подвержены полному распаду. Необходимо отметить, что на момент отбора проб для анализа в субстратах под воздействием микробных ферментов происходят сложные процессы изменения количественного соотношения ПАУ. Возможно этот процесс обусловлен явлением конденсации частично окисленных углеводородов. Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты с увеличением срока культивации.

Исследования проводились с использованием ранее описанных методов и сред, однако были внесены некоторые изменения:

1.Применялись более крупные фрагменты, чем ранее. Линейные размеры фрагментов составляли 10х10х20 см (кубики).

2.При формировании среды в ферментационных емкостях объемом
10 литров было произведено разбавление пропитанных креозотом кубиков чистыми кубиками, щепой и опилками в соотношении 1:1.

Посевной материал вносился в количестве 10%. Температура инкубации составляла 28ОС. Субстрат периодически увлажняли разбавленным водопроводной водой неохмеленным пивным суслом (2% сахаров).

Культура Trichoderma lignorum № 37 активно колонизирует поверхность кубиков, причем начальное прикрепление и активное размножение начинается с чистых, не содержащих ПАУ кубиков. Такая последовательность, по-видимому, связана с адаптацией культуры и накоплением в среде активных ферментов. К исходу 20-х суток культура колонизирует до 70% поверхности субстрата.

Отбор проб производился на 30-е и 40-е сутки инкубации.
Определение содержания ПАУ в образцах проводили в соответствии с раннее указанным методом. Результаты анализа представлены в таблице
6:

таблица 6
| |содержание ПАУ в образцах, мг/кг |
|вещество | |
|держание ПАУ |контроль |30 суток |40 суток |
|Нафталин |7 |3,8 |0,42 |
|Аценафтен |16 |2,5 |1,1 |
|Аценафтилен |170 |1,7 |0,31 |
|Флуорен |337 |8,3 |0,91 |
|Фенантрен |797 |1230 |7,4 |
|Антрацен |303 |320 |2,1 |
|Флуорантен |619 |1450 |9,8 |
|Пирен |382 |630 |3,1 |
|Бензантрацен |94 |37 |7,9 |
|Хризен |50 |42 |3,8 |
|Бенз(b)флуоранте|5,5 |29 |0,87 |
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте|23,5 |39 |0,94 |
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |15 |9,6 |0,29 |
|Дибензантрацен |3,5 |24 |0,99 |
|Бензперилен |10 |69 |0,32 |
|Инденопирен |1 |49 |1,3 |

Как видно из представленных данных на 30-е сутки процесса микробной деструкции сохраняется накопление ПАУ, отмеченное раннее.
Увеличивается количественное содержание инденопирена (контрольный образец-1 мг/кг, 30-е сутки- 49 мг/кг), бензперилена, дибензантрацена и бенз[к]флуорантена. По сравнению с раннее полученными результатами на 30-е сутки обнаружено дополнительное увеличение содержания бенз[в]флуорантена (в 5 раз), незначительное увеличение пирена, флуорантена и антрацена. Это объясняется перераспределением вещества между компонентами смеси ПАУ в процессе микробной переработки и меньшей скоростью деструкции, обусловленной переходом к более крупным фрагментам субстрата- кубикам.

По видимому для более полного разрушения ПАУ требуется более длительный срок ферментации. Результат анализов проб отобранных по истечении 40 суток убедительно показал, что только содержание инденопирена сохраняется на прежнем уровне (контрольный образец-1 мг/кг, 40-е сутки-1,3 мг/кг). Содержание всех остальных компонентов смеси к исходу 40-х суток резко снизилось и достигло минимальных значений. На 40-е сутки инкубации исчезает, отмеченное раннее явление накопления полиядернях компонентов смеси, связанное с конденсацией продуктов частичной деструкции.

Параллельно нами был изучен процесс деструкции смеси ПАУ грибом Phanerochaete chrysosporium. Этот микроорганизм является самым перспективным среди микромицетов деструктором ароматических ксенобиотиков, ему посвящено огромное количество работ. Однако сведений по деструкции им многокомпонентных смесей ПАУ в литературе так же не оказалось. В этой связи имело смысл изучить данный вопрос. В соответствии с раннее описанными методиками был изучен процесс деструкции ПАУ. В качестве субстрата использовали кубики, анализ содержания ПАУ проводили методом хромато-масс-спектроскопии.
Результаты исследования представлены в таблице 7.

Как следует из приведенных экспериментальных данных, гриб
Phanerochaete chrysosporium активно разрушает ПАУ. Причем важно отметить, что раннеее наблюдаемое явление перераспределения ПАУ сохраняется и в случае Phanerochaete chrysosporium (инденопирен, бензперилен, дибензантрацен). Вместе с тем к исходу 40-х суток содержание ПАУ в субстрате резко снижается.

Таким образом подтверждается принцип последовательного окисления ПАУ и общность механизмов деструкции этих веществ у различных микроорганизмов.

таблица 7
| |содержание, |
|вещество |мг/кг |
| |контроль |30 суток |40 суток |
|Нафталин |7 |2,1 |1,1 |
|Аценафтен |16 |1,2 |1,9 |
|Аценафтилен |170 |0,98 |0,54 |
|Флуорен |337 |2,9 |0,82 |
|Фенантрен |779 |790 |14 |
|Антрацен |303 |190 |5,4 |
|Флуорантен |619 |840 |210 |
|Пирен |382 |280 |64 |
|Бензантрацен |94 |23 |11 |
|Хризен |50 |30 |32 |
|Бенз(b)флуоранте|5,5 |5,7 |9,4 |
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте|23,5 |36 |20 |
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |15 |4,4 |0,49 |
|Дибензантрацен |3,5 |8,3 |9,5 |
|Бензперилен |10 |17 |3,8 |
|Инденопирен |1 |21 |7,9 |

7.2.3.Применение облучения ((=257,3 нм) для предобработки ПАУ- содержащих субстратов

В природных условиях ПАУ разлагаются под воздействием комплекса многочисленных факторов: микробной деструкции климатических условий и некоторых других. Солнечный свет несомненно должен оказывать влияние на ПАУ. Для проверки этого предположения нами была создана лабораторная установка (рис.3.) с газоразрядной лампой ПРК-7 ((=257,3 нм). Кюветы с измельченными фрагментами пропитанной креозотом древесины (фрагменты 5 мм) помещали в кюветы и подвергали облучению. Во избежание перегрева поверхности субстрата установка работала периодически, не более 4-х часов в сутки. Пробы отбирали по истечении 16-ти и 20-ти часов облучения.
Анализ содержания ПАУ проводили по методике, описанной раннее.
Результаты экспериментов представлены в таблице 8: таблица 8
| |содержание, |
|вещество |мг/кг |
| |контроль |16 часов |24 часа |
|Нафталин |22 |0,26 |0,10 |
|Аценафтен |7 |0,58 |0,76 |
|Аценафтилен |86 |0,40 |0,52 |
|Флуорен |86 |14 |8,9 |
|Фенантрен |1840 |140 |93 |
|Антрацен |600 |24 |24 |
|Флуорантен |1430 |640 |110 |
|Пирен |520 |490 |27 |
|Бензантрацен |230 |3 |9,9 |
|Хризен |160 |24 |41 |
|Бенз(b)флуоранте|45 |24 |23 |
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте|34 |13 |14 |
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |35 |7,3 |4 |
|Дибензантрацен |18 |5,8 |5,3 |
|Бензперилен |10 |16 |6,5 |
|Инденопирен |9 |14 |21 |

Из таблицы 8 видно, что под воздействием ультрафиолетового излучения происходит деструкция ПАУ. Зафиксировано снижение содержания нафталина, антрацена, флуорена и фенантрена в 10-20 раз.
Содержание аценафтилена уменьшилось в 170 раз. Аналогично ведут себя большинство компонентов смеси.

Следует отметить, что обнаруженное нами явление фотолиза ПАУ хорошо совпадает с раннее опубликованными данными. Так французские исследователи показали благоприятное воздействие фотолитической деструкции антрацена и его превращение в антрахинон для последующей деструкции ассоциацией морских микроорганизмов /47/. Авторы отмечают, что разрушение 50% антрахинона в глубинных условиях происходит за 10 суток. Анализ продуктов распада показал наличие следовых количеств бензойной и фталевой кислот (рис.7.).

Рис.7.Процесс фотолитической деструкции антрацена

Необходимо отметить, что окисление антрацена и его превращение в антрахинон, по видимому, является инициирующим фактором для последующей микробной деструкции.

Анализ экспериментальных данных показывает, что бензперилен и инденопирен являются наиболее устойчивыми к действию облучения.
Аналогичная картина наблюдалась и при микробной деструкции ПАУ. По- видимому, это явление, обнаруженное при деструкции ПАУ различными методами, может объясняться увеличением реакционной способности продуктов фотолитической и микробной деструкции ПАУ.

Из раннее приведенных данных видно, что первоначальной общей стадией разложения ароматического кольца является его окисление. В дальнейшем такие структуры, как, например о-оксибензойная кислота, продукт разложения нафталина, легко вступают в реакции присоединения с более сложными продуктами деструкции, например, с окисленной формой пирена, с образованием и накоплением в системе инденопирена (рис.8.):

Рис.8.Образование инденопирена

Высказанное предположение и возможный механизм протекания реакций между продуктами деструкции нуждается в дополнительной экспериментальной проверке. Однако, явление фотолитической деструкции ПАУ можно использовать для предобработки этих веществ при проведении их микробной утилизации.

7.2.4.Происхождение микроорганизмов-деструкторов ПАУ

Интенсивное промышленное воздействие на окружающую среду началось сравнительно недавно - в XIX веке. Очевидно, что за столь короткий промежуток времени не могли эволюционировать ферментные системы, способные разрушать ПАУ. Однако литературные данные
/4,6,11,14,37,/ и наши собственные эксперименты показывают, что современные микроорганизмы такой способностью обладают, то есть в их геноме уже есть гены деструкции этих веществ.

Вероятнее всего, что появление первых микроорганизмов, разрушающих ПАУ следует отнести к эпохе появления первых сосудистых растений, содержащих лигнин в клеточной стенке - древовидных папоротников. Возраст самых древних папоротникообразных составляет около 380 млн. лет (конец Силурийского периода) /48/. Древесина современных растений содержит ряд веществ, имеющих в своем составе нафталиновое ядро /15/. Под воздействием солнечного света и микроорганизмов (собственные данные), а также при горении биомассы
/49/, могут образовываться (в результате процессов конденсации) более сложные ПАУ. Таким образом на Земле были все условия для естественного отбора микроорганизмов-деструкторов ПАУ, естественным резервуаром являются почва и лесная подстилка. Логично предположить, что эти микроорганизмы, после интродукции могут приобрести способность разрушать полиароматические вещества и фенолы. В случае низкой субстратной специфичности ферментной системы микроорганизма возможно разрушение ароматических экотоксикантов-ксенобиотиков (нитротолуолы, нитрофенолы, хлорфенолы ит.д.).

7.2.5.Анализ возможности создания систем по утилизации твердых ПАУ- содержащих отходов

В связи с ухудшением экологической обстановки перед исследователями встала задача разработки методов утилизации вредных отходов производства и коммунального хозяйства.

Предложенные нами методы фотолитической предобработки техногенных, ПАУ содержащих субстратов, и их микробной деструкции позволяют создать производство по утилизации коммунальных отходов, содержащих ПАУ. Примером таких отходов является листовой опад крупных городов, загрязненнй как ПАУ, так и маслами, смолами и жидкими нефтепродуктами. Предобработку фотолизом можно осуществлять без особых затрат выдерживая субстраты на специальных площадках.
Летом для качественной предобработки будет достаточно 4-5 солнечных дней. Далее субстраты перемещают в ферментационные ангары и вносят увлажняющую среду и посевной материал. Инкубацию ведут при температуре 20-30ОС в течении 40-60-ти суток (в зависимости от ПДК экотоксикантов). Производственный процесс желательно вести в теплое время года (с мая по октябрь) так как в этот период не требуется расходовать энергию на обогрев ферментационных ангаров. В процессе ферментации образуется компост, который можно использовать как почвообразователь. Схема установки по переработке ПАУ содержащих отходов представлена на рисунке 9:

Рис.9.Схема установки по утилизации ПАУ содержащих отходов

8.Стандартизация

В работе использовались материалы, приборы, оборудование, посуда, отвечающие государственным и отраслевым стандартам.
Перечень стандартов приведена в таблице 9:

9.Охрана труда и окружающей среды

Мероприятия, проводимые в разделе ’’Охрана труда и окружающей среды’’ очень важны, так как их выполнение обеспечивает безопасность проводимых экспериментов для человека и окружающей среды.

9.1.Характеристика опасных и вредных производственных факторов

Согласно /50/ ,опасные и вредные производственные факторы делятся на следующие группы: физические, химические, биологические и психофизические. К физическим опасным и вредным производственным факторам относят электричество, ультрафиолетовое излучение. Группа химических опасных и вредных производственных факторов и их воздействие на человека представлены в таблице 10, которая составлена в соответствии с /1,51,52,53/.

Биологические опасные и вредные производственные факторы отсутствуют, так как используемые микроорганизмы являются непатогенными.

9.2.Пожаробезопасность

Так как мы не можем рассчитать пожарную нагрузку, то нельзя определить категорию помещения по /54/. Согласно ПУЭ-85 /55/, класс взрывоопасной зоны лаборатории В-1б. На случай пожарной опасности в лаборатории имеются средства огнетушения: огнетушители марки ОХЛ-
10, ОУ-2, ящик с песком, асбестовые одеяла. В целях электробезопасности все приборы в лаборатории заземлены.

Характеристика физико-химических, пожаровзрывоопасных и токсичных свойств сырья, готового продукта и отходов производства

таблица 10

| |Физико-химические свойства |Пожаровзрывоопасные свойства /52/ |Токсические свойства |
| |вещества /51/ | | |
| | | | | |Температура|Пределы распространения | | | |
| | | | | |, tо C |пламени | | | |
| |Агрега|Темпер|Темпер|Плот| | |Температурны|Концентрационн| | Класс| |
|Вещест-|т-ное |а-тура|а-тура|-нос|Вспы|Само-|е, tоС |ые, об. % | | |ПДКр|
|ва |состоя|кипени|плавле|ть, |шки |воспл| | | |опасно|.з |
| |ние |я, |- | | |а- | | |Характер действия|сти |мг/м|
| | | | |кг/м| | | | |на | |3 |
| | | | |3 | | | | | | | |
| | |tоС |ния, | | |менен| | | | |организм |/53 / |/ |
| | | |tоС | | |ия |нижни|верхн|нижний|верхни|человека / 2 / | |53/ |
| | | | | | | |й |ий | |й | | | |
| | | | | | | | | | | |Действует на ЦНС | | |
|Этанол |ж |78.5 |-114.6|785 |13 |400 |11 |41 |3.6 |17.7 |и печень |IV |1000|
|Нафтали|тв |218 |80.28 |1140|80 |520 |- |- |0.9 |- |Действует на ЦНС,|IV |20 |
|н | | | | | | | | | | |желудок, почки. | | |
| | | | | | | | | | | |Лейкоцитоз | | |
|Антраце|тв |351 |216, 6|1132|121 |472 |- |- |- |- |Фотодерматит, |- |- |
|н | | | | | | | | | | |эритема | | |
|Аценафт|тв |270 |92 |1160|- |- |- |- |- |- |Действует на |- |- |
|илен | | | | | | | | | | |кожу, слизистую | | |
| | | | | | | | | | | |оболочку | | |
|Аценафт|тв |279 |96 |831 |- |359 |- |- |12 |- |Действует на |III |10 |
|ен | | | | | | | | | | |почки, печень | | |
|Пирен |тв |392 |149 |1277|- |- |- |- |- |- |Лейкоцитоз, |- |- |
| | | | | | | | | | | |нарушения функции| | |
| | | | | | | | | | | |печени | | |

9.3.Санитария и гигиена

Обеспечение нормальных санитарно-гигиенических условий в лаборатории необходимо для нормальной работы персонала и уменьшения опасности профессиональных заболеваний и травм.

Для обеспечения нормальных метеорологических условий и чистоты воздуха в лаборатории установлена вытяжная вентиляция 2Ш-НЖ
/56/ ,скорость движения воздуха 0,4 метра в секунду. Согласно /57/ необходимо соблюдать следующие правила работы с приточно-вытяжной вентиляцией:

Страницы: 1, 2, 3, 4

МЕНЮ

Микробная утилизация полиароматических углеводородов

ИНТЕРЕСНОЕ