Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе

зависимости от клинического статуса, показатели фагоцитоза, пропердина,

комплиментарной и бактерицидной активности (до поения молозивом, на 2, 5,

10, 20 и 30 день жизни).

Бактерицидные свойства колостральной сыворотки и сыворотки крови

новорожденных телят изучали нефелометрическим методом. Профилактические и

лечебные свойства молозивных сывороток и лактоглобулина изучались на

лабораторных животных и телятах.

Коррекцию иммунодефицита неонатальных телят, проводили с применением

лактоглобулина и витамина А.

В качестве анти-секреторных факторов, ингибирующих циклический

аденозинмонофосфат (сАМР) применяли хлорпромазин и Т-активин.

Опыты проводились на 562 телятах, 468 коровах, 247 белых мышах и 30

кроликах.

Полученный цифровой материал подвергался биометрической обработке по

различным биометрическим методикам: [Дж. У. Снедекор, 1961; И. П. Ашмарин,

А. А. Воробьев, 1962; В. Ю. Урбах, 1964; Е. В. Гублер, А. А. Генкин А. А.,

1969].

2.1.2. Приготовление колибактериозного антигена. Для приготовления

антигена использовали три серотипа колибактерий: О78:К80, О119:К69 и

О137:К79.

Использованные серотипы Е. coli по морфологическим и биохимическим

свойствам были типичными, отвечающими требуемым иммуногенным, антигенным н

вирулентным свойствам.

Е. coli О78:К80, О119:К69 и О137:К79 раздельно высевали в пробирки с

мясопептонным бульоном на 12 ч и проверяли на чистоту (микроскопия мазков,

окрашенных по Граму). В последующем бульонную культуру высевали на

стерильный мясопептонный агар в матрацах. Посевы выращивали в термостате в

течение 18 ч при температуре 37° С, проверяли на чистоту и смывали

стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Для выделения О-антигена

бактериальную суспензию автоклавировали при 120°С в течение 2 ч дня

разрушения К-антигена. Густую отмытую суспензию Е. coli содержащую 10 млрд.

микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту, смешивали с ацетоном в

отношении 1:5 до появления коагуляции (свертывания). Плотную часть

материала отбирали на воронке Бюхнера, промытой один раз ацетоном и затем

высушенной эфиром. Препарат высушивали на воздухе и хранили при 4°С.

Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1

мг высушенных ацетоном бактерий на 1 мл барбиталового буфера.

Для выделения К-антигена бактериальную суспензию получали путем смыва из

агаровых культур изотоническим раствором хлорида натрия, содержащего 0,5 %

формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона

непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. [E. Neter, E.

A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter,

1957].

Полученные О- и К-антигены проверяли на стерильность и на безвредность.

Стерильность устанавливали путем высева на МПБ, МППБ и МПА. Посевы

выдерживали 10 дней в термостате (+37°С). Безвредность антигенов была

проверена на лабораторных животных. Для этого каждый из антигенов вводили

10 белым мышам под кожу в области спины по 0,5 мл и 5 морским свинкам в

области внутренней поверхности задней конечности по 1,0 мл. Клинические

наблюдения за опытными животными вели в течение 15 дней.

Отсутствие роста в посевах на МПБ, МППБ и МПА и гибели привитых животных

позвонило считать антигены стерильными и безвредными. Хранились антигены

при температуре +4 +5°С в холодильнике.

2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и

О137:К79 Е. coli. Для определения агглютиногенности изучаемых серотипов

использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и К-

антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих

дозах (от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.

Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей

соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной

баней при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.

Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя

формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение

сыворотки 1:10.

Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой

реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии

культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты

учитывали в течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали

пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген

живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа,

в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в

течение трех минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную

реакцию. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O.

Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].

2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока. Кровь от животных

(коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в

термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной

температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в

стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).

Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела,

а затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.

Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На

каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и

после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при

температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от

сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам

через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем

через бактериальный фильтр Зейтца.

2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В

центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина,

приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл

исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания

ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво

отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000

об/мин в течение 30 мин.

С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в

разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра

сыворотки. Контроли обычные.

Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и

помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили

предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через

24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.

2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления

агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию

агглютинации, которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в

пробирках с ровным округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами

(серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 Е. coli ).

Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли

двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива

производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.

После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали,

затем помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого

производили предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки

выдерживали 24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный

результат.

Для учета результатов реакции агглютинации пользовались четырех

крестовой системой обозначения. За агглютинационный титр принимали то

наибольшее разведение сывороток, при котором еще наблюдалась видимая

агглютинация, оцениваемая в четыре креста.

2.1.7. Определение активности лизоцима в сыворотке крови. Сыворотку

крови, отделяли общепринятым методом. Предварительно готовили 1/15М

фосфатный буфер (рН 6,2), для чего использовали два исходных раствора:

4,539 г х. ч. КН2РО4 растворенный в 500 мл дистиллированной воды и 2,375 г

х. ч. Nа2НРО4Ч12Н2O, растворенный в 200 мл дистиллированной воды. При

смешивании этих растворов в определенном соотношении, получали рН буфера

6,2.

Для приготовления 1 % агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере брали 1 г

сухого агара, помещали в колбу на 200 мл и заливали 99 мл 1/15М фосфатного

буфера. Колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, помещали в кипящую баню и

выдерживали 25-30 мин.

Расплавленный агар охлаждали до 60-70°С и вносили в него ацетоновый

порошок Micrococcus lysodeikticus из расчета 10-20 мг на 100 мл объема.

Необходимое количество порошка перед внесением в агар суспендировали в 3-5

мл 1/15М фосфатного буфера. Полученную смесь перемешивали до получения

однородной взвеси.

Полученную смесь разливали в чашки Петри с таким расчетом, чтобы

подучить толщину слоя 4 мм.

После застывания агара в нем при помощи тонкостенной трубочки вырезали

лунки диаметром 5 мм на расстоянии 2-3 см от краев чашки и друг от друга.

Для подсыхания лунок чашки помещали в термостат приоткрытыми на 60 мин.

Исследуемые пробы сыворотки крови разводили соответственно 1/15М фосфатным

буфером 1:10, 1:2 и 1:5. Каждую пробу после разведения заливали в отдельную

лунку в объеме 0,05 мл.

Параллельно с исследуемым материалом 1/15М фосфатным буфером разводили

стандартный кристаллический лизоцим так, чтобы получить его растворы с

концентрацией 0,5 мкг/мл, 1; 3; 5; 10; 20; 40; 60; 80 и 100 мкг/мл. По 0,05

каждого разведения стандартного лизоцима разливали по отдельным лункам.

Чашки Петри с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом выдерживали

48 ч во влажной камере при комнатной температуре (22-24°С).

После экспозиции при помощи линейки измеряли диаметр зон лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунок с исследуемым материалом и

стандартным лизоцимом.

Первоначально на полулогарифмической бумаге строили калибровочную

кривую, используя результаты, полученные при измерении зон лизиса вокруг

лунок с раствором стандартного лизоцима в различных концентрациях. Для

этого значения, отражающих диаметры зон лизиса субстрата в миллиметрах,

откладывали по оси абсцисс, а показатели концентрации стандартного лизоцима

в мкг/мл, вызывающих лизис по оси ординат. Точки пересечения первых и

вторых значений соединяли между собой, при этом получалась прямая линия.

Расчет результатов проводили следующим образом. Диаметр зоны лизиса

Micrococcus lysodeikticus вокруг лунки с сывороткой крови составил 9,5 мм.

На калибровочном графике этому значению соответствовала концентрация 2,5

мкг/мл стандартного лизоцима. Сыворотку крови перед исследованием разводили

1:10 1/15М фосфатным буфером. Следовательно, концентрация лизоцима в

исследуемой пробе сыворотки крови равнялась 2,5Ч10=25 мкг/мл. Так как,

литическая активность стандартного лизоцима изменяется в результате

изготовления и хранения, полученное абсолютное значение выражали в единицах

относительной активности. Активность стандартного лизоцима составляла 20600

ед/мг или 20,6 ед/мк, активность лизоцима исследуемой пробы сыворотки

молозива равнялась 20,6Ч25 =515,0 ед/мл.

2.1.8. Определение содержания комплемента в сыворотке крови.

Исследовали сыворотку крови, полученную из яремной вены животных.

Предварительно готовили веронал-мединаловый буфер: 0,575 г веронала

растворяли в 50 мл дистиллированной воды, подогретой до 60° С, охлаждали и

добавляли 8,5 г хлорида натрия, 0,375 г мединала, 0,5 мл раствора

содержащего 1 М MgCl2 и 0,3 М CaCl2 (100 мл Н2О + 19 г MgCl2Ч6Н2О г + 6 г

CaCl2). Объем доводили до 200 мл дистиллированной водой. Буфер хранили в

холодильнике. Перед употреблением буфер разводили дистиллированной водой

(1:4). Физиологический раствор: 8,5 г хлорида натрия растворяли в 1 л

дистиллированной воды и фильтровали.

Эритроциты барана. Кровь у барана брали из яремной вены в колбу с бусами

и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания.

Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли. Эритроциты

барана отмывали 3 раза центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин. Из

отмытых эритроцитов готовили 5 % взвесь на физиологическом растворе и

стандартизовали на ФЭК. С этой целью эритроциты лизировали: к 1 мл отмытых

эритроцитов добавляли 9 мл дистиллированной воды. Лизированные эритроциты

фотоколориметрировали при зеленом светофильтре против воды. Оптическая

плотность лизата — 1,08 при длине 541 мкм в кювете 10 мм.

Для определения титра гемолизина, готовили вначале основное разведение

гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл буфера), затем из

этого разведения поучали разведения от 1:1000 до 1:4000.

| |1:1000 |1:1200 |1:1500 |1:2000 |1:2500 |1:3000 |1:3500 |1:4000 |

|Буфер, мл |0,9 |1,1 |1. 4 |1,9 |2,4 |2,9 |3,4 |3,9 |

|Гемолизин |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |

Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5

% взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли

равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз

наблюдался в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для

приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной

гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической

системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для

сенсибилизации эритроцитов барана.

Исследуемую сыворотку, разводили 1:10, разливали в 10 пробирок и

доводили буферным раствором (физиологическим) до 1,0 мл. После этого в

каждую пробирку добавляли 1 мл гемолитической системы, то есть

сенсибилизированных эритроцитов барана, 2-я пробирка — контрольная.

|Исследуемая сыворотка|0,05|0,1 |0,15|0,2 |0,25|0,3 |0,35|0,4 |0,45|0,5 |

|(1:10), мл | | | | | | | | | | |

|Буферный раствор |0,95|0,9 |0,85|0,8 |0,75|0,7 |0,65|0,6 |0,55|0,5 |

|Сенсибилизированные |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |

|эритроциты барана | | | | | | | | | | |

Пробирки инкубировали при 37° С в течение 45 мин, охлаждали в

холодильнике 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали

на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды и определяли

процент гемолиза.

Для определения активности комплимента в гемолитических единицах

готовили шкалу и кривую гемолиза. Для приготовления шкалы гемолиза к 1 мл

стандартной 5 % взвеси эритроцитов барана прибавляли 3 мл дистиллированной

воды в результате чего происходил гипотонический лизис эритроцитов (100 %

гемолиз). Пробирку центрифугировали (при 1500 об/мин 10 мин) и готовили

шкалу гемолиза:

|100 % гемолиз эритроцитов|0,1 |0,2 |0,3 |0,4 |0,5 |0,6 |0,7 |0,8 |0,9 |1,0 |

|на дистиллированной воде | | | | | | | | | | |

|Буферный раствор, мл |0,9 |0,8 |0,7 |0,6 |0,5 |0,4 |0,3 |0,2 |0,1 |0 |

|Гемолиз, % |10 |20 |30 |40 |50 |60 |70 |80 |90 |100 |

Полученные разведения и исходный раствор колориметрировали на ФЭК в

кюветах (1 мм) и строили график зависимости коэффициентов экстинции от

процента гемолиза. На оси абсцисс откладывали процент гемолиза, на оси

ординат — показатели экстинции, соответствующие данному проценту гемолиза.

Расчет 50 % гемолитических единиц комплемента в 1 мл проводили следующим

образом. После титрования исследуемой сыворотки, инкубации ее при 37° С в

течение 45 мин, выдержки в течение 10 мин в холодильнике при 4° С и

центрифугирования пробирку из шкалы гемолиза с одной 50 % единицей

комплемента (№5) сравнивали с пробирками из ряда титрования сыворотки. Если

содержимое пробирки №5 соответствовало по цвету пробирке №6, из ряда

титрования комплемента исследуемой сывороткой, то есть дозе комплемента 0,3

мл, то расчет вели следующим образом.

0,3 мл сыворотки (разведение 1:10) соответствует одной 50 %

гемолитической единице комплемента, а в 1 мл исследуемой сыворотки

содержится:

0,3 мл (1:10) — 1

1,0 мл — Х

Х =[pic] = 3,33 ел/мл.

2.1.9. Определение содержания пропердина в сыворотке крови. Для

определения титра пропердина исследуемую сыворотку разводили мединал-

вероналовым буфером (рН 7,2-7,4), начиная с 1:10 до 1:320. В центрифужные

пробирки вносили по 0,2 мл каждого разведения сыворотки, до 0,2 мл

суспензии инулина (соответствует 3 мг сухого вещества) и по 0,2 мл

комплемента в рабочем титре. В контрольный ряд пробирок вместо инулина

добавляли по 0,2 мл буфера. Все пробы (опытные и контрольные) помещали на 1

ч в термостат при 37° С, после чего центрифугировали, переносили

супернатант в отдельные пробирки по 0,3 мл и добавляли по 0,2 мл

стандартной гемолитической системы. Реакцию учитывали после 20-минутной

экспозиции при 37° С. За титр пропердина принимали то наибольшее разведение

сыворотки, в котором наблюдается полная задержка гемолиза, и в каком

разведении в контрольном ряду отличается полный гемолиз. Данные

рассчитывали по формуле:

|Разведение, в котором отмечен|— |Разведение, в котором отмечена |Ч10 |

|полный гемолиз в контроле | |полная задержка гемолиза в опыте| |

|Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле |

Полученные результаты выражали в ед/мл. При полной задержки гемолиза в

разведении 1:35 в опыте, а в контроле — полный гемолиз в разведении 1:50,

содержание пропердина в 1 мл испытуемой сыворотки составляет:

[pic]Ч10 = 3 ед/мл.

Тестированные показатели: комплементарную, лизоцимную, пропердиновую

активность, а также содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови, молоке и

молозиве крупного рогатого скота определяли по методам В. Г. Дорофейчук,

1968; X. Я. Грант, Л. И. Яворский, И. А. Блумберг, 1973; И. М.

Архангельский, 1976; В. Н. Андреев, Г. И. Подопригора, 1977; Е. С.

Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1977; О. Н. Грызлова, П. А.

Емельяненко, В. Н. Денисенко, 1978; Э. Бем, 1979; П. А. Емельяненко, О. И.

Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; Э. С. Коган, 1981; Г. В.

Павлов, Г. Н. Печникова, Смолянская- О. О. Суворова, 1988; В. В.

Биктимиров, 1993.

При определении лизоцима, учитывая замедленную активность фермента

крупного рогатого скота, приводили тщательную подготовку материалов к

исследованию, чтобы избежать ошибок, связанные с действием на тест-микробы

других литических факторов исследуемой пробы.

При тестировании комплементарной активности сыворотки крови тщательно

осуществляли подбор индикаторной системы чувствительной к комплементу

крупного рогатого скота.

Для определения пропердина использовали модифицированный метод

предложенный П. А. Емельяненко и др., 1980.

2.1.10. Изучение бактерицидной активности сывороток крови. Для

определения бактериостатической и бактерицидной активности сывороток крови

О. В. Смирнова, Т. А. Кузьмина (1966) предложили фотонефелометрический

метод.

В нашей работе мы учитывали изменения оптической плотности питательной

среды с микробами и питательной среды с испытуемой сывороткой крови и

микробами сразу после соединения и через 3-, 5-, 7-, 9-, 12- и 24-часовой

инкубации.

Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на МПА и

выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем смывали

стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали до

содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев

на МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной

температуре.

Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали

питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9