Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе

мг% амминного азота.

В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали

по 4,5 мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой

сыворотки крови и суточную бульонную культуру Е. coli по одной

бактериологической петле (диаметр петли 4 мм).

Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той

лишь разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл

стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет

тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все

кюветы закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды

определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр.

После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно

определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24

ч. Установку «0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной

дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови

проводили по формуле:

А=100- [pic]Ч100,

Где: А — бактерицидная активность (в %);

Д — оптическая плотность;

Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).

Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА)

по формуле:

Средняя НБА = [pic],

Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной

сыворотки;

А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная активность сыворотки молозива через 3,

5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);

Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).

2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке

опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я.

Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в

термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в

течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим

раствором хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до

2-х млрд. микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной

бане при 70° С в течение 30 мин.

Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую

культуру Е. coli.

Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные

стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного

раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно

смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного

перемешивания пробирки помещали в термостат при 38° С на 3 мин,

предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38° С.

Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе,

нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по

Романовскому-Гимза.

Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду

усредняли фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия

(Na2HPO4Ч12H2O) — 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат калия

(KH2PO4) — 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру дистиллированной воды

прибааляли по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды был равен

6,813.

Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл

усредненной воды с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали

водопроводной водой и высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали

под иммерсионной системой микроскопа и окуляра 7Ч.

Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На

основе подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число

поглощенных микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент

фагоцитирующих нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450

реакций.

2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови,

молозиве и молоке крупного рогатого скота.

Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г

натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO4Ч12H2O) и 5,84 г хлорида

натрия помещали в мерную колбу, растворяли в дистиллированной воде и

доводили объем до 1 л. Подобным образом готовили раствор из 4,08 г

однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) и 5,84 г хлорида натрия.

Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении

обеспечивающим рН буфера 8,0.

Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной

вены животных 20-30 мин при 37° С в термостате. После отделения

образовавшегося сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь

помещали на 16-20 ч в холодильник. На следующий день сыворотку отсасывали в

стерильную центрифужную пробирку, центрифугировали 15-20 мин при 3000

об/мин.

Пробы молозива и молока после взятия выдерживали 16-20 ч при 4° С и

центрифугировали в течение 1 ч при 6000 об/мин. Затем снимали верхний слой

жира, отсасывали надосадочную жидкость, которую и использовали для

определения.

Пластинки из 3 %-ного агара «Дифко», смешанного с антисывороткой

готовили следующим образом: 360 мг агара помещали в колбу, заливали 12 мл

буфера и прибавляли 0,25 мл 1 %-ного раствора мертиолата. Колбу помещали в

баню с холодной водой, которую затем нагревали до кипения и выдерживали

смесь до полного расплавления агара.

После расплавления гель охлаждали до 56° С и к нему приливали равный

объем антисыворотки в рабочем разведении и снова нагревали до температуры

56° С. Смесь тщательно перемешивали и выливали на стекло, помещенное на

столике с уровнем в строго горизонтальном положении.

После застывания геля в нем делали лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15

мм друг от друга.

При определении содержания иммуноглобулина G пробы сыворотки крови

разводили буфером рН 8,0 в 20 и 30 раз. Пробы молозива первого дня лактации

в 100, 50 и 20 раз, пробы молозива последующих дней лактации — в 50, 20 и

10 раз, использовали не разведенные и разведенные в 10 раз пробы молока.

При определении содержания иммуноглобулина М пробы сыворотки крови и

молозива разводили в 10 и 5 раз, пробы молока использовали не разведенными

и разведенными в 5 раз.

При определении содержания иммуноглобулина А пробы сыворотки крови

использовали не разведенными, пробы молозива и молока — не разведенными и

разведенными в 5 и 2 раза.

Пробы сыворотки крови получали от новорожденных телят до приема молозива

во всех случаях использовали не разведенными.

Подготовленные пробы крови, молозива, и молока вносили в лунки геля с

антисывороткой с помощью пастеровской пипетки. При этом лунку заполняли

полностью, не переливая пробы за ее пределы.

Параллельно с опытными пробами на каждом стекле ставили контроль —

разливали в лунки стандартный препарат определенного иммуноглобулина. При

этом его разводили буферным раствором с таким расчетом, чтобы в 1 мл

раствора препарата содержалось 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мл белка.

Таким образом, на каждом стекле получалось 6 лунок с контрольной пробой

препарата.

После заполнения лунок, стекла помешали в эксикатор с водой и

выдерживали при комнатной температуре, при определении содержания

иммуноглобулинов G и А в течение 24 ч, а при определении иммуноглобулина М

— 48 ч.

По окончании сроков инкубации стекла извлекали из эксикатора и измеряли

диаметр кольца преципитата вокруг лунок с помощью линейки Беринг-Верке,

после окрашивания агаровых пластин. С этой целью стекла с агаром погружали

на двое суток в буфер. В течение этого срока буфер трижды заменяли новой

порцией. После отмывания от не участвующих в реакции веществ, пластинки

агара высушивали при комнатной температуре под фильтровальной бумагой.

Затем пластинки (без фильтровальной бумаги) помещали в 0,1 %-ный раствор

амидо-черного 10В на 3 ч, промывали трехкратно раствором уксусной кислоты и

высушивали.

Для приготовления 0,1 %-ного раствора амидо-черного 10В, брали 1 г

краски, растворяли в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН), после чего

объем раствора доводили дистиллированной водой до 1 л. Раствор хранили в

темной посуде при комнатной температуре. Раствор уксусной кислоты для

промывания: брали 70 мл ледяной уксусной кислоты и доводили объем

дистиллированной водой до 1 л.

Для расчета содержания иммуноглобулинов в испытываемых пробах строили

калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге: на оси ординат

откладывали концентрацию белка в пробах стандарта, по оси абсцисс — диаметр

кольца преципитации. Калибровочную кривую строили отдельно по каждому

иммуноглобулину определенного класса.

Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяли путем сравнения

диаметра кольца преципитации вокруг ее лунки с калибровочной кривой [G.

Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; У. Дж. Герберт, 1974; В.

М. Чекишев, 1977; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н. Печникова и М.

Н. Тулупова, 1980; P. В. Петров, 1987; Н. С. Жосан, 1989; Н. В. Матузенко,

Е. В. Андреев, А. И. Собко, 1990].

2.1.13. Экспресс-метод для определения содержания иммунных глобулинов.

Кровь получали от телят из яремной вены до приема молозива и через 24 ч

после рождения. Сначала ее выдерживали около часа в (30-35° С), а затем в

холодильнике 10-12 ч. После чего отделяли сыворотку в отдельные пробирки.

Раствор цинк сульфата (208 мг/л ZnSO4Ч7H2O) готовили в мерной колбе на

дистиллированной воде, которую выдерживали 4-5 дней и затем кипятили в

течение 10-15 мин с целью растворения диоксида углерода.

Для приготовления стандарта мутности брали 3 мл раствора хлорида бария

(BaCl2Ч2H2O) в 100 мл дистиллированной воды, вносили в мерную колбу на 100

мл и доводили до метки 0,2N раствором серной кислоты. Полученный раствор

соответствует 20 ед. цинк сульфатному тесту [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I.

E. Selman and W. J. Penhale, 1970].

Калибровочную таблицу для калориметрического определения содержания

иммуноглобулинов на ФЭК-56М получали путем разведения стандарта мутности.

Для определения иммунных глобулинов подбирали пробирки одинакового

диаметра и наливали в каждую по 6 мл цинк сульфатного раствора, а в

контрольною пробирку — 6 мл дистиллированной воды. Во все опытные пробирки

(по количеству образцов) и в контрольную добавляли по 0,1 мл исследуемой

сыворотки и выдерживали при комнатной температуре (20° С) 60 мин. После

экспозиции пробирки взбалтывали, чтобы обеспечить одинаковое

перераспределение осадка и помещали в фотоэлектроколориметр, который

предварительно устанавливали на «0» по дистиллированной воде. Измерение

проводили на ФЭК-56М, ври длине волны 400±5 нм (синий светофильтр) в

кюветах толщиной слоя 10 мм. Показание прибора ФЭК-56М определяли образцах

сыворотки через контрольную пробирку умножением различия на фактор 10. 20

единиц цинк сульфатного теста помутнения были эквивалентны соответственно

20-30 мг/мл содержания колостральных иммунных глобулинов в сыворотке крови

теленка [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].

2.1.14. Определение уровня пассивной защиты у новорожденных телят. Метод

основан на том, что белки сыворотки крови могут преципитироваться

различными солями, включая сульфит натрия (Na2SO3). Этот феномен зависит от

концентрации соли и молекулярной характеристики белков. Готовили 14-, 16-,

и 18 %-ный растворы Na2SO3, используя для этих целей безводный реактив.

Соответственно 14, 16 и 18 г его растворяли в 100 мл дистиллированной воды.

Кроме безводного сульфита натрия использовали Na2SO3Ч7Н2О, при этом

количество его для приготовления соответствующих концентраций увеличивали

вдвое.

В пробирки вносили по 1,9 мл раствора сульфита натрия каждой

концентрации и добавляли по 0,1 мл испытуемой сыворотки. Пробирки тщательно

встряхивали и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Реакцию считали

отрицательной, если преципитат не образуется и положительной, если видны

хлопья преципитированного белка или заметно даже небольшое его присутствие,

в данном случае уровень иммуноглобулинов в испытуемой сыворотке

соответствует промежуточному значению. Концентрация иммуноглобулина меньше

5 мг/мл соответствовала помутнению при концентрации 18 %; от 5 до 15 мг/мл

— 16 и 18 %, и больше 15 мг/мл — 14, 16 и 18 % сульфита натрия. [N. E.

Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel

and J. M Weikel, 1977; Ю. Н. Федоров, 1988].

Сывороточный гемолиз не влиял на результаты преципитации

иммуноглобулинов.

2.1.15. Выделение лактоглобулина из колостральной сыворотки.

Лактоглобулины из сыворотки молозива получали солевым методом. За основу

взяли методику фракционного высаливания противогриппозных сывороток.

К сыворотке добавляли два или три объема дистиллированной воды в

зависимости от содержания белка. В смесь, при перемешивании мешалкой,

добавляли тонкой струей насыщенный раствор сернокислого аммония. После

тщательного перемешивания смесь оставляли в покое на 10-15 ч в холодильнике

до полного формирования осадка.

Лактоглобулин сыворотки молозива подвергался высаливанию 38 объемными

процентами насыщенного раствора сернокислого аммония по формуле:

Х=[pic],

где: Х — объем насыщенного раствора сернокислого аммония;

С — требуемая концентрация сернокислого аммония;

Y — объем разбавленной молозивной сыворотки.

рН насыщенного раствора сернокислого аммония — 7,3-7,5.

Выпавший осадок лактоглобулина отделяли от раствора путем фильтрации

через воронку Бюхнера с двойным слоем хроматографической бумаги.

Плотный осадок переносили в целлофановые мешочки и подвергали диализу в

проточной водопроводной воде, а затем в дистиллированной воде до тех пор,

пока в растворе не обнаруживалось даже следов сернокислого аммония, что

проверяли реактивом Несслера.

По окончании диализа определяли концентрацию белка (рефрактометрически)

в растворе лактоглобулина и дистиллированной воды разбавляли его до

содержания 10 % белка. К раствору добавляли хлорид натрия до изотонического

насыщения.

Подученный препарат подвергали стерилизующей фильтрации через фильтр

Зейтца с пластинкой СФ и расфасовывали по ампулам и флаконам.

Стерильность полученного препарата подтверждали высевом на МПБ, МПА и

среду Китт-Тарроци, а безвредность на белых мышах и морских свинках. Посевы

выдерживали в термостате при 37° С восемь суток. Лактоглобулин вводили

подкожно двум морским свинкам массой 230-240 г в дозе по 3 мл и четырем

белым мышам массой 16-18 г по 0,5 мл с последующим наблюдением за животными

в течение 5 дней.

Исключение примесей балластных белков в препарате производили

электрофоретически. Препарат хранили в холодильнике при температуре +3 +5°

С.

2.2. Изучение специфической иммунологической реактивности телят в

постнатальный период.

Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива и

через 24 ч после рождения определяли цинк-сульфатным методом [A. D. MсEwan,

E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].

Концентрацию иммуноглобулинов молозива коров с учетом их возраста

вычисляли по уровням линейной регрессии [H. Balbierz, M. Nicolaijczuk, J.

Zeilinski, 1983].

Эффективность колостральных иммуноглобулинов изучали по отношению

содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови неонатальных телят к

количеству поступивших с молозивом.

Количественную характеристику абсорбции колостральных иммуноглобулинов

классов G, М и А устанавливали методом радиальной иммунодиффузии [G.

Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; В. М. Чекишев, 1977].

Выделенные иммуноглобулины классов G, М и А служили антигенами для

иммунизации кроликов [R. A. Wilson and I. W. Jutila, 1976] с целью

получения соответствующих моноспецифических антисывороток.

Степень катаболизма иммуноглобулинов изучали определением их классов в

сыворотке крови методом радиальной диффузии. Иммуноглобулины в фекалиях

определяли по E. F. Logan, W. J. Penhale, 1972; Р. П. Маслянко, 1982.

После измерения диаметров зон преципитации концентрацию иммуноглобулинов

рассчитывали математическим способом, исходя из прямо пропорциональной

зависимости между ней и квадратом диаметра кольца [Э. Бем, 1979].

Колостральную сыворотку отделяли после добавления сычужного фермента.

Лактоглобулин получали добавлением к сыворотке молозива насыщенного

раствора сульфата аммония с последующим диализом против 0,01М рН 7,6

Na2HPO4; KН2PO4.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с

использованием критерия достоверности Стьюдента.

2.2.1. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема

молозива и через 24ч после рождения и взаимосвязь между концентрацией

иммуноглобулинов и проявлением синдрома нарушения пищеварения. Проведенные

исследования показали, что концентрация колостральных иммунных глобулинов в

крови телят до приема молозива составила 0,18±0,08 мг/мл, этот уровень

главным образом связан с IgМ. Через 24 часа после приема молозива

содержание иммуноглобулинов достигло 23,94±1,71 мг/мл или увеличилось в 133

раза (табл. 2.1).

Таблица 2.1

Содержание иммунных глобулинов в сыворотке крови новорожденных телят

(n=20).

| |яя |сия |е |арифмети|ь |ый |ельная |

| |ская,| |ое | |ий | |ность),|

|До приема |0,18 |0,0035|0,019 |0,008 |0,02 |0,16-0,20 |11,1 |

|Через 24 ч |23,94|14,69 |3,83 |1,71 |4,75 |18,19-28,69|19,8 |

| | | | | | | | |

|II группа — |18,26|0,16 |0,4 |0,18 |0,49 |17,77-18,75|2,68 |

|III группа — |15,37|0,66 |0,43 |0,19 |0,53 |14,84-15,90|1,24 |

Новорожденные телята с содержанием иммуноглобулинов 23,94± 1,71 мг/мл

(доверительный интервал 19,19-28,69 мг/мл) переболели легкой формой

колибактериоза на третьи сутки. Даже такая высокая концентрация

иммуноглобулинов не обеспечивала иммунологический статус новорожденных

телят, что связано со значительной инфицированностью внешней среды и

снижением вследствие этого защитного уровня молозива.

Содержание иммуноглобулинов через 24 часа в сыворотке крови телят сильно

варьирует и составляет от 19,85 мг/мл до 29,11 мг/мл. Такая разница

объясняется количеством проглоченного теленком молозива.

Способность новорожденных животных адаптироваться к изменениям внешней

среды лимитировано и изменение условий, не влияющих на взрослых животных,

может плохо отразиться на состояние здоровья телят. Известно, что стресс

является способствующим фактором возникновения колибактериоза у телят.

Причиной стресса могут быть различные нарушения условий содержания, порой

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9

МЕНЮ

Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе

ИНТЕРЕСНОЕ