| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
МЕНЮ
| Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животныхМетодические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животныхМинистерство сельского хозяйства Российской Федерации Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия Кафедра физиологии сельскохозяйственных животных и зоологии Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животных Ульяновск, 2005 г. УДК Н.А.Любин, Л.Б.Конова. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. Для студентов и аспирантов факультетов ветеринарной медицины и технологического. Ульяновск, ГСХА, 2005, с. При подготовке настоящих рекомендаций был использован опыт работы… РЕЦЕНЗЕНТ: В.А.Ермолаев, доктор ветеринарных наук, профессор Рекомендовано к изданию методической комиссией факультета ветеринарной медицины Протокол № от 2005 г. Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия, 2005 г МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКОВ КРОВИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ А. ВЗЯТИЕ КРОВИ И ПОЛУЧЕНИЕ МАЗКА Циркулирующая в сосудистой системе кровь представляет более или менее равномерную взвесь в плазме форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов и кровяных пластинок (у птиц, рептилий и амфибий — тромбоцитов). Абсолютное количество и соотношение отдельных групп клеток в крови различных видов животных неодинаковы. Наибольшие колебания дают эритроциты: от 3,5 млн. в 1 мм 3 крови кур до 14,4 млн. в том же объёме крови коз. Несколько меньше видовые колебания количества белых кровяных телец: в 1 мм 3 крови млекопитающих содержится от 5 до 15 тыс. лейкоцитов. Количество лейкоцитов в крови птиц значительно выше: у кур, например оно, доходит до 35 тыс., а у гусей до 38 тыс. в 1 мм 3. Наконец, содержание кровяных пластинок в 1 мм3 крови колеблется от 200 до 400 тыс. В крови, взятой из различных участков сосудистой системы, находится далеко не одина- ковое количество кровяных телец, особенно, и это наиболее важно, лейкоцитов. Значительно колеблется при этом и соотношение отдельных форм белой крови (табл.1,2). Таблица1 Количество лейкоцитов в различных участках кровяного русла у кроликов
Если принять среднее количество лейкоцитов в 1 мм3 крови из ушной вены за 100%, то в крови из сосудов других органов содержится: Поэтому важно брать кровь для анализа всегда из одного и того же сосуда или группы сосудов. У всех сельскохозяйственных млекопитающих таким местом являются вены уха, у кур — гребень, у уток и гусей — мякоть ступни ноги. Таблица 2 Состав белой крови свиней
Количество лейкоцитов зависит и от физиологического состояния животного. У многих сельскохозяйственных и лабораторных животных заметно выражены пищеварительный лейкоцитоз (особенно у собаки), менее у лошади, и колебания количества лейкоцитов и (особенно) эритроцитов при мышечной работе. При некоторых патологических состояниях имеет место ретенция белых кровяных телец в сосудах печени и надпочечника. Лейкоцитоз наблюдается также во второй половине беременности. Место взятия крови тщательно выстригается и если нужно, промывается водой с мылом, затем спиртом (или спиртом с эфиром). Рекомендуется тщательно растирать место взятия крови ваткой со спиртом и эфиром, что вызывает местную гиперемию и вместе с тем помогает избежать случайных колебаний лейкоцитарной формулы, связанных с некоторым застоем крови в мелких венах уха. Особенно следует иметь в виду возможное избирательное скопление в них эозинофилов. Хорошие мазки крови можно получить только на очень чистых, обезжиренных предметных стёклах, тщательно промытых сначала горячей водой с мылом, а затем, после высушивания, — спиртом с эфиром. Промывание в спирте с эфиром особенно важно для полного обезжиривания стёкол. Если используются уже бывшие в употреблении стёкла, то их необходимо предварительно прокипятить в воде с содой. Прокол тканей для получения крови лучше всего производить иглой Франка, но можно употреблять и обыкновенную иглу или специальное перо для уколов. Первую выступившую на поверхность каплю крови быстро и тщательно стирают с места укола, а из второй и последующих приготовляют мазки. Приготовление мазка крови. Чистое предметное стекло держат, как показано на рисунке 1, между большим и средним пальцами левой руки. В правой руке, теми же или большим и указательным пальцами держат чистое покровное или тонкое шлифованное предметное стекло. По крайней мере, одно ребро таких стёкол должно быть уже ширины того предметного стекла, на котором приготовляют мазок. Обычно это достигается подбором или обламыванием углов шлифованного стекла. Рис. 1. Приготовление мазка крови. Поверхностью предметного стекла, зажатого в левой руке, осторожно, но быстро касаются выступившей из прокола капли крови, стараясь сделать это ближе к среднему пальцу и, сейчас же, приведя стекло в горизонтальное положение, прикладывают к его поверхности узкое ребро того стекла, которое держат в правой руке. Приложенное ребро должно лежать перпендикулярно к длинным граням предметного отекла, а самое приложенное стекло нужно наклонить в сторону капли под углом в 40—50°. Держа это стекло, таким образом, осторожно двигают его в сторону капли до соприкосновения с нею. Как только капля, коснувшись подвижного стекла, разойдётся по линии соприкосновения стёкол, верхнее наклонное стекло быстрым, но ровным движением направляют обратно, в сторону большого пальца, сохраняя всё время прежний угол наклона в 40—50°. Полученный таким способом мазок высушивают на воздухе и на нём пишут иглой название или номер животного, его пол ((J или Q), и дату взятия крови. Можно изготовлять мазки и на покровных стёклах. Для этого одним покровным стеклом берут очень маленькую каплю крови и прикладывают к нему другое покровное стекло так, чтобы углы одного стекла легли на середину рёбер другого. Как только капля крови разойдётся тончайшим слоем между обоими стёклами, последние параллельным движением в противоположные стороны разводятся, и, таким образом, получаются два мазка. В. ФИКСАЦИЯ МАЗКА Чтобы закрепить все форменные элементы крови в препарате с максимально возможным сохранением их структуры и подготовить мазки к последующей окраске, существуют различные методы фиксации мазков. Наибольшее практическое значение имеют: 1. Фиксация абсолютным метиловым спиртом. Это лучший метод фиксации. Сухие мазки на 3 минуты погружаются в абсолютный метиловый спирт или на то же время спирт наливается на мазок, вполне покрывая препарат. Через 3 минуты мазки вынимают (или сливают с них спирт) и просушивают на воздухе. 2. Фиксация абсолютным этиловым спиртом, смешанным с равным количеством эфира. Фиксация длится 10—30 минут в обычных сосудах для гистологических растворов. Этот способ значительно хуже, так как даёт много артефактов. В. ОКРАСКА МАЗКА. ОСНОВНОЙ МЕТОД ОКРАСКИ ПО РОМАНОВСКОМУ Посредством окраски препарата наиболее отчетливо выявляется тончайшая структура, как ядра, так и цитоплазмы. Принцип современных методов окраски мазков крови открыт в 1891 г. Д. Л. Романовским и заключается в избирательном поглощении (химическом и коллоидальнохимическом) веществами клетки трёх красящих веществ — азура метиленовой синьки и эозина. Азур («красная из метиленовой синьки») имеет амфотерноосновную реакцию, метиленовая синька — щелочную, эозин — кислую. Ядро клетки, богатое нуклеопротеидами и нуклеотидами, базофильно, т. е. окрашивается основными красками с избирательным поглощением а з у р а. Цитоплазма молодых клеток, относительно богатая нуклеиновыми кислотами (нуклеотидами), также, хотя и в меньшей степени, базофильна. При этом избирательно поглощается преимущественно метиленовая синька. Цитоплазма же многих зрелых клеток крови (прежде всего нейтрофилов) ацидофильна (оксифильна). Лимфоциты сохраняют базофилию цитоплазмы на всех стадиях развития, избирательно поглощая метиленовую синьку. Наличие базофилии молодой цитоплазмы, указывающее на относительное богатство её нуклеиновыми кислотами, связано с сохранением способности молодых клеток к интенсивному синтезу белков. Лимфоциты сохраняют эту способность на весь онтогенез. Базофилия гранул базофилов определяется наличием в них кислой слизи (мукоитиносерная кислота). В лабораторной практике чаще всего пользуются следующими способами окраски по методу Романовского. Окраска раствором Гимза Краска Гимза, применяемая при окраске по методу Романовского, представляет собой комбинацию метилен-азура (азур II) и эозина (В, жёлтого). Она состоит из азура II*—3,0, эозина В —0,8, химически чистого глицерина 250,0 и метилового спирта 250,0. Эта краска обычно отпускается готовой. Очень многое в успехе окрашивания определяет безупречное качество раствора краски, а последнее в высшей степени зависит от реакции воды. Для приготовления рабочего раствора краски употребляется дважды дистиллированная вода. Обычно она имеет рН=5,4, т. е. слишком кисла, и даёт слабую, плохую окраску. Поэтому такую воду нужно подщелочить, прибавив к 2—3 л воды несколько капель 1-процентного раствора соды. Лучшим рН воды следует считать 6,8—6,9 (до 7,1). При более щелочной реакции воды мазки получаются более синими (даже эритроциты). Практически пригодность воды к окраске определяют по растворению в ней гематоксилина. В 10 см3 дистиллированной воды (лучше всего в часовом стёклышке) кладут пинцетом несколько крупинок гематоксилина. Не ранее как через 1 минуту и не позже 5 минут вода должна окраситься в ясный слабофиолетовый цвет. Более раннее и интенсивное окрашивание указывает на сильно щелочную реакцию, более позднее — на кислую. Если нет очень хорошего гематоксилина, то реакцию воды, подщелачиваемой раствором соды, можно определить, пользуясь в качестве индикатора нейтральной красной. В два химических стакана (или колбы Эрленмейера) наливают по 200 см3 дистиллированной воды и прибавляют 1 — 2 капли 1-процентного раствора нейтральной красной. При рН дистиллированной воды, равном 5,4—5,5, получается свекловично-красная (рубиновая) окраска. После этого в один из стаканов прибавляют по капле, тщательно размешивая, 1% раствор соды до появления слабого оранжевого оттенка (цвет лососины). Нельзя доводить воду до ясно оранжевого и, тем более, жёлтого цвета, так как в этом случае реакция будет сильно щелочной. Более кропотливо пользоваться индикаторами Михаэлиса и менее точно — универсальным индикатором. Лучше всего для получения нужной и стойкой реакции воды применять буферные растворы. Хорошими буферными растворами для этой цели будут фосфатные. Для них нужно иметь два исходных раствора: 1. Двуосновного фосфата натрия (Na2HP04. •2Н20)—17,814 г на 1 л (рН =8,302). 2. Одноосновного фосфата калия (КН2Р04) — 13,638 г на 1 л (рН =4,529). Азур II — смесь в равных частях красок: азур I (диметилтиониохлорид) и метиленовой синьки. В постаревшем растворе исходной краски Гимза метиленовая синька часто плохо окрашивает цитоплазму лимфоцитов (нет чисто голубого цвета). Тогда необходимо добавить метиленовой синьки в исходный раствор краски. Если к литру дистиллированной воды прибавить по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды будет равен 6,813. Случайные колебания концентрации углекислоты в воздухе при таком способе не оказывают влияния на рН воды. Перед окраской (ex tempore) к дистиллированной воде прибавляют исходный раствор краски Гимза из расчёта 1,0—1,5 капли краски на 1 см3 воды. Рабочий раствор краски наливается пипеткой (осторожно!) на предметное стекло так, чтобы препарат (мазок крови) был полностью покрыт краской. Стёкла помещаются над широкой чашкой Петри на стеклянных палочках, соединённых резиновыми трубками попарно. Во избежание осадков, которые невозможно отмыть, можно стёкла укладывать мазками вниз, на стеклянные палочки, лежащие в чашке Петри, так, чтобы краска покрывала мазки полностью (способ академика Н. Д. Стражеско). При первом способе на один мазок тратится 2,5— 3,0 см3 рабочего раствора краски. Через 20—30 минут краску сливают, препараты промывают водопроводной чистой водой и высушивают на воздухе. Для окраски старой краской требуется меньше времени. При окраске раствором Гимза хорошо дифференцируется структура ядра, несколько хуже — структура цитоплазмы, особенно нейтрофильная зернистость. Однако при очень умелом окрашивании и зернистость выявляется достаточно хорошо. По этому методу плохо окрашиваются псевдоэозинофилы (палочкозернистые гранулоциты) крови сельскохозяйственных птиц. Окрашенные краской Гимза ядра имеют красивый фиолетово-красный цвет (цвет вишни); нейтрофильная зернистость — розовато-фиолетовый; эозинофильная зернистость — розовый или красно-розовый; базофильная —цвета мальвы; азурофильная — красно-фиолетового цвета. Цитоплазма лимфоцитов — голубая, моноцитов — от голубовато-серой до пепельно-серой. Эритроциты — красновато-розового цвета, полихроматофилъные эритроциты — синеватые, базофильная пунктация эритроцитов — синяя. Если нет хорошей готовой краски Гимза, то можно хорошо окрасить мазки по Н о х т у. Для окраски по Нохту приготовляется два раствора: 1) 1-промил-льный раствор азура II; 2) 1-промилльный раствор эозина. Перед приготовлением рабочего раствора краску нужно оттитровать. Для этого сначала берут на 3 см3 дистиллированной воды 4 капли раствора азура II и 3 капли раствора эозина (т. е. в отношении 4 : 3). Если окраска мазков неправильна, пробуют отношение 4 : 4, или 4 : 5, или 4 : 6, и т. д. Достаточно интенсивное окрашивание получается, если на 1,5 см3 азура II берётся 1,0 см3 эозина и 6 см3 воды. Модификация Паппенгейма (Май-Грюнвальд — Гимза) При этом способе окраски предварительная фиксация мазка не нужна, так как первая краска — Май-Грюнвальд имеет растворителем метиловый спирт. Метод окраски двухмоментный. Сперва мазок покрывают 2 см3 неразведённой краски Май-Грюнвальд, представляющей собой раствор в метиловом спирте эозина и метиленовой синьки. Если нет готовой надёжной краски, то растворяют приготовленный фабричным способом сухой порошок Май-Грюнвальд: 1,0 г порошка на 100 см3 абсолютного метилового спирта и 50 см3 чистого глицерина. Хорошая краска получается и без глицерина. Через 3 минуты к краске Май-Грюнвальд, находящейся на мазке, прибавляют 2 см3 дистиллированной воды и тщательно смешивают их продуванием или последовательным набиранием и выпусканием через тонко оттянутую пипетку. Когда, примерно через 1 минуту, мазок приобретает розовый оттенок, краску с препарата сливают и после этого, не высушивая, 10—12—15 минут красят мазок рабочим раствором краски Гимза, а затем промывают чистой водопроводной водой. Этот способ окраски удачно сочетает хорошее выявление зернистости клеток краской Май-Грюнвальд с чёткой окраской структуры ядра раствором Гимза. Такая окраска особенно ценна для выявления псевдоэозинофилов (специальных гранулоцитов) куриной крови. Результаты окраски: ядра красно-фиолетовые, цитоплазма лимфоцитов голубовато-синяя, азурофильная зернистость лимфоцитов пурпурно-красная, миелоидная азурофилия фиолетово-коричневая, так же как и центральная субстанция кровяных пластинок. Нейтрофильная зернистость коричневато-красная, до синевато-розовой; эозинофильная — от красно-оранжевой до кирпично-красного цвета; базофильная зернистость тёмного ультрамариново-фиолетового цвета (метахромазия); эритроциты медно-розовые; полихроматофильные эритроциты синеватые; базофильная пунктация эритроцитов (слабо выявляемая) синего цвета *. В целом, мазки, окрашенные по этому способу, несколько богаче оттенками, чем при окраске раствором Гимза, но кажутся более тёмными, «мрачными». Цветные таблицы картин крови выполнены с препаратов крови, окрашенных по Романовскому в модификации Паппенгейма, лучше всего диференцирующей структуру клеток. Ускоренная окраска раствором Гимза (новая модификация) Этот метод даёт хорошие результаты только в руках опытного исследователя. Преимущество — быстрота приготовления препарата, так как фиксация и окрашивание происходят одновременно. Для работы необходимы капельницы ёмкостью в 30 см3, в которые наливается исходный раствор краски Гимза, разведённый пополам метиловым спиртом или чистейшим ацетоном. В хорошо закупоренной склянке этот раствор может сохраняться месяцами. Окрашивание производится или в чашках со специальными перекладинками, или в обычных чашках Петри. На свежий мазок (не позднее 2-дневного!), высушенный на воздухе и не фиксированный, наливают из капельницы около 20 капель краски. Чтобы предохранить краску от испарения, чашка, в которой лежат препараты, закрывается стеклом. Через 1/2 минуты — 1 минуту к краске на мазке приливают около 10 см3 подщелочённой дистиллированной воды (1—2 капли 1-процентного раствора щелочи на 50 см3 воды). Покачиванием чашечки хорошо перемешивают краску с подлитой водой. Через 10— 15 минут воду с краской сливают и мазок промывают водопроводной (недистиллированной!) водой. В случае приготовления основного раствора с ацетоном особенно хорошо выявляется зернистость структура ядер кровяные пластинки. • Описание цветов дано, с некоторыми небольшими изменением, по А. II. Крюкову. Окраска крови и кровепаразитов по Г. Эпштейну Фиксация метиловым спиртом Готовят два раствора. 1-й: дистиллированной воды 100 см3; лимоннокислого лития — 1 г; толуидиновой голубой — 1г. После разведения профильтровать. 2-й: насыщенный водный раствор пикриновой кислоты. Мазки красят 20—30 минут в первом растворе и, ополоснув в проточной воде, помещают на 1—2 секунды во второй раствор (пикриновой кислоты). Промывают (тщательно!) снова в водопроводной воде и после этого быстро обсушивают фильтровальной бумагой. Окраска: эритроциты зелёные; ядра лейкоцитов фиолетово-синие; базофильная зернистость вишнёвая; эозинофильная зернистость изумрудно-зелёная; нейтрофильная зернистость серая; у кровепаразитов ядро красное, а цитоплазма синяя. Окраска составом Лейшмана На нефиксированный препарат налить 15—20 капель готового раствора краски Лейшмана (0,1 г порошка краски растворить в 10 см3 метилового спирта). Через 2,5—3 минуты прибавить 30 капель дестиллированной воды и красить ещё 5 минут. Промыть в течение 2—3 минут проточной водой и высушить на воздухе. Специальные способы окраски и фиксации мазка а) Получение и окраска толстой капли. На хорошо промытое (подщелочённой водой, затем спиртом с эфиром) предметное стекло наносят 2 крупные капли крови. Собственно, достаточно одной капли, но вторая служит «резервом» на случай неосторожного стирания одной капли, неудачи окраски и т. д. Каждая капля сейчас же, с помощью иглы, распределяется по стеклу ровным слоем — примерно в 1\4 - 1\2 мм толщины, чтобы получились пятна размером с десятикопеечную монету. Препараты тщательно высушиваются (в термостате при 37° или на солнце) в течение получаса. Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 |
ИНТЕРЕСНОЕ | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|