Литература - Другое (книга по генетике)

режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи-

цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для

каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,

длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич-

ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой

термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и

состав амплификационной смеси могут существенно варьировать

и зачастую подбираются эмпирически.

С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места

локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а

также изучать наличие любых других специфических особен-

ностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на

основании анализа нуклеотидной последовательности амплифици-

руемого участка. Разработаны различные варианты автомати-

ческого поиска последовательностей ДНК, использование кото-

рых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации

специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибри-

дизация проходила строго специфично, праймеры не должны со-

держать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отме-

чали, что для проведения ПЦР достаточно минимального коли-

чества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные

органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, уг-

леводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не

препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве

источника матричной ДНК может быть использован любой, даже

деструктурированный биологический материал, сохранивший в

своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных

молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищен-

ной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна

крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины

хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, куль-

туры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не

прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитоге-

нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен-

ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши-

еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более

подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде

специальных руководств и инструкций.

Существуют различные модификации ПЦР, которые исполь-

зуются в зависимости от конкретных целей проведения реакции

или от характера последующего молекулярного анализа амплифи-

катов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержа-

щих различные повторяющиеся последовательности или необычные

структурные элементы), а также в тех случаях, когда матрич-

ная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в

два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором

этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации,

продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих

случаях для повышения специфичности праймирования используют

систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров,

то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают

последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в

первом раунде участка ДНК.

В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР,

то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат-

ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в

реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания зас-

луживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК.

На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии

генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить,

что реакцию амплификации можно проводить не только в раство-

рах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при

этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты

амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементар-

ные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase

reaction in situ). До настоящего времени доступными амплифи-

кации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В

последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усо-

вершенствований (особый подбор праймеров, использование сра-

зу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специ-

ального температурного режима полимеразных циклов), возможно

проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В

частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со

вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et

al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократ-

но будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР,

так как этот метод по праву стал один из основных в молеку-

лярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;

Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).

Возможность очень точного и специфичного выбора участ-

ка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых мо-

лекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку-

лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную

ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиоле-

те в виде красной полосы после электрофоретического концент-

рирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.

Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот

гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.

При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках

ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза коли-

чество и положение окрашенных полос на геле изменяется в

соответствии с положением этих сайтов (Рис. 1.11 ). Путем

электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в

размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет

делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной мат-

ричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых

молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также

структурные изменения в дуплексах между нормальными и му-

тантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, на-

конец, возможно определение полной нуклеотидной последова-

тельности синтезированных молекул с идентификацией всех му-

таций в исследуемом районе матричной ДНК (см. Главу IV).

Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преиму-

щественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна-

чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более

подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью

ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ

определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом

отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК пу-

тем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.

Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и

клонирования потеряли свою актуальность. Без их использова-

ния невозможна молекулярная идентификация генов, предшеству-

ющая разработке методов молекулярной диагностики с использо-

ванием ПЦР.

ГЛАВА VI.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.

Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор

адекватных биологических моделей.

Молекулярная идентификация гена, нарушение работы кото-

рого приводит к развитию наследственного заболевания, созда-

ет предпосылки для дальнейшего более подробного анализа ге-

нетических и биохимических основ патогенеза и разработки на

этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные

этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследо-

вание механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции

активности генов в нормальных клетках, оценку клинического

выражения различных типов нарушений гена, выявление первич-

ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку-

лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.

Естественно, что в различных тканях организма

экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.

Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо-

зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе-

чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По

весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че-

ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках

печени - основной биохимической лаборатории организма - око-

ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,

1977). Это означает, что в различных соматических клетках

эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,

1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо-

дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про-

цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях

организма происходит избирательная активация многих других

специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает

значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско-

рости их синтеза.

Контроль генной активности осуществляется за счет диф-

ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд-

рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной

трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным

результатом которой является синтез функционально активного

белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной

активности, но и полноценность всех последующих этапов,

включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность

к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и

корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре-

шающее значение для успешного анализа всего этого сложного

комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по-

иск и целенаправленное конструирование которых представляет

вполне самостоятельную научную задачу.

Наиболее доступными модельными системами для анализа

экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для кло-

нирования, генноинженерного манипулирования, направленного

введения сайт специфических мутаций, получения большого ко-

личества клонированных последовательностей ДНК, специфи-

ческих молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно

используют генетически хорошо изученные прокариотические

системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов

трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внут-

риклеточной локализации и функционирования чаще используют

культуры клеток эукариот и, в частности, специфические куль-

туры клеток человека. Особая роль в изучении начальных эта-

пов развития патологического процесса, обусловленного

присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевти-

ческих методов, включая генноинженерную коррекцию метаболи-

ческого дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это

могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полу-

ченные из специфических тканей больного человека, либо выде-

ленные из тканей линейных животных, служащих генетической

моделью наследственного заболевания.

Идентификация гомологичных генов у экспериментальных

животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряют

исследование функциональной активности нормальных и мутант-

ных генов человека. Большая роль в изучении молекулярных ме-

ханизмов развития патологических процессов in vivo принадле-

жит генетическим линиям животных. Это могут быть линии, по-

лученные в результате отбора спонтанно возникших или индуци-

рованных мутаций, а также искусственно сконструированные мо-

дели на базе трансгенных животных, в геном которых введен

чужеродный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспе-

риментальные подходы, используемые для анализа экспрессии

генов.

Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция

и исследование мРНК, искусственные

транскрипционные системы.

Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок

может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В

соответствии с этим исследования дифференциальной активности

генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы

контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех

этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и

изучение соответствующего белкового продукта, включая его

процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тка-

неспецифическое распределение .

Исследования регуляторных цис-действующих элементов ге-

нома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляю-

щие транскрипцию, являются составной частью анализа молеку-

лярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов

проводят с использованием разнообразных современных методов

молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в

5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспеци-

фическую индукцию генной активности, могут быть локализованы

путем исследования транскрипции в различных линиях клеток

при введении в них генов с искусственными делециями этих

участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регу-

ляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо

изученными неиндуцибельными клонированными генами, так назы-

ваемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в

составе векторных последовательностей вводят в культивируе-

мые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня

экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хло-

рамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естест-

венных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.

Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволя-

ет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в

клетке, но и с высокой точностью проводить количественную

оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии хи-

мерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек

африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки моди-

фицированы таким образом, что в них после трансфекции про-

исходит амплификация копий сконструированных определенным

образом эписом (внехромосомных генетических конструк-

ций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сиг-

налов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов

(трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого орга-

низма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных

манипуляций трансгенные животные могут быть также использо-

ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов

тканеспецифической активации генов in vivo.

Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для

изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных

модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95%

из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли-

руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При

этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов

среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от

0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения

индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко-

чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на

тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ

РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических

срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов

используют клонированные последовательности кДНК и синтети-

ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на

цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой

несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо-

вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли-

бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме-

тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не

только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде-

лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,

Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).

Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей

пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика-

цию среди них специфических молекул путем использования раз-

личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким

уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты

(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не

могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-

лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и

фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про-

водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью

обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-

ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон-

центрированных и фракционированных путем электрофореза моле-

кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в

агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В

этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель

находится в логарифмической зависимости от длины последова-

тельности, что позволяет точно определить размер РНК

транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде

двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-

мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы

в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой

отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибри-

дизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то

преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены мо-

лекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.

Кроме того, характер электрофоретического разделения позво-

ляет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень

низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях,

когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими

компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной

тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках

фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35