Литература - Другое (книга по генетике)

крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин,

входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дист-

рофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре

после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин

присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном

состоянии.

В соответствии с современными представлениями (Ahn,

Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем слож-

ной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней

мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную

специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и

на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора

экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время

как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисклю-

чающим способом. Высоко консервативные последовательности 6-

и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайси-

руются, образуя несколько структурно различающихся форм

дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифи-

цирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являюще-

еся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тка-

нях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок

значительно отличается от дистрофина и его уровень в некото-

рых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в

мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса,

экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в

Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам

дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок полу-

чил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще

один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистро-

фин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et

al., 1993).

В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаружи-

ваются протяженные делеции, захватывающие от одного до

нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух

"горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и

в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализова-

ны в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Прокси-

мальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогене-

зе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.

Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как

изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях

повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной

делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4%

(Passos-Bueno et al., 1992).

Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в

разных европейских популяциях, а также в популяциях России и

стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов де-

летирован не только весь ген, но достаточно протяженные

соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в

центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44,

протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек раз-

рыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной

из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подоб-

ного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспо-

зонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у ко-

торого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы,

размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, пов-

торены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза неста-

бильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подоб-

ного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких

случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у паци-

ентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть

имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В

2-х случаях дупликаций из 8, для которых был проведен сик-

венс концевых участков, показано присутствие Alu-элементов.

В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не-

гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992).

Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и

протяженностью делеции не отмечается, но различия между фор-

мами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием

или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина мо-

жет быть вовлечен также в другие структурные перестройки -

дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена

дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мута-

ции, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нук-

леотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий

процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с

присутствием большого количества глютаминовых триплетов, му-

тации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.

Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с

МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преи-

мущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследствен-

ные формы.

Разработаны очень эффективные методы диагностики деле-

ций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновре-

менное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена поз-

воляет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et

al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства де-

леций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопи-

ческой DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амп-

лификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование

(Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод

иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на

гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et

al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют

косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген-

ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;

124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотид-

ных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малыше-

ва и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и

др., 1990).

Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного

носительства и, следовательно, для медико-генетического

консультирования предствляют случаи, так называемого, гонад-

ного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад

женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою

очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов)

половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами

дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возни-

кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ран-

них стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ори-

ентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случа-

ев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оце-

нить величину аберрантного клона ооцитов практически не

представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении

здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери

больного МД не удается определить гетерозиготное носительст-

во, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при нали-

чии спорадического случая рождения ребенка с МД и при

отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного

носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторно-

го рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et

al.,1992).

У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногисто-

химическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистро-

фин-положительные волокна. Однако, при использовании антител

с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным

участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от-

вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероят-

ный механизм такого явления - возникновение второй сомати-

ческой делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки

считывания, вызванный основной делецией. В результате му-

тантный ген может транскрибироваться с образованием стабиль-

ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).

Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -

mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,

спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,

1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается

резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол-

ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини-

ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована

нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей

транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже-

на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо-

на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).

В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи-

альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина

человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали

после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер-

ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро-

фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив-

ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,

1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-

венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант-

ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной

ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных

(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче-

видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да-

лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты

исследователей о перспективности генной терапии МД по срав-

нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных

миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини-

ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу

IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи-

мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро-

фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен-

но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования

по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и

в нашей стране.

10.4.3 Гемофилия А.

Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное

наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в

системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора

YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х

компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном

F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя-

зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге-

ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули-

рует его активность.

Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер-

жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая

длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо-

дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009

нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность

(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806

п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в

интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не-

известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами

молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт-

роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в

направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый

экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие

его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется

он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена

экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;

Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22

оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-

ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи-

тельное место локализации бинаправленного промотора для ге-

нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб

в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые

копии гена F8A (Lakich et al.,1993).

Во время процессинга первичного белкового продукта гена

F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от-

щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В

плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого

гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и

N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с

гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко-

личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-

тивность белка сохранена, но его количество резко снижено

(McGinnis et al.,1993).

Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -

семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают

в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal

et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,

что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя-

ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме

того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,

могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что

вероятность повторного рождения больного ребенка у них также

повышена.

Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв-

ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При-

мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика-

ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis

et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова-

на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло-

кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них

представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,

Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах

встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на

основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего

большинства мутаций гена F8C характерно практически полное

отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по

гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение

составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя-

женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол-

ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа-

лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А

(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена

является гомологичная рекомбинация между идентичными после-

довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22

F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на

расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).

Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре-

гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,

связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен-

тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен-

ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк-

зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et

al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1

последовательности представляют собой специфическое для ге-

нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов-

торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и

состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба

L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот-

ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et

al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10

F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле-

мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре-

конструируемые аминокислотные последовательности были высоко

идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.

Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде-

ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую-

щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-

зиции.

Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу-

ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c

последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1

(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия

мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные

методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют

полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по-

лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне-

генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,

1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).

Учитывая наличие функционально активной формы белка

фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии

этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-

ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо

на введение в организм больного соответствующей кДНК,

обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу-

ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого

гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о

получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен

ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты

полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо-

левания находится на стадии экспериментальных разработок

(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов

человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная

проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив-

ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена

могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены

невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель-

ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож-

ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,

гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап-

равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные

модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35