Литература - Другое (книга по генетике)

1 сМ соответствует 1% рекомбинации. Общая длина генома че-

ловека в этих единицах составляет около 3300 сМ. Сопостав-

ляя эту величину с размером гаплоидного набора молекул ДНК,

можно заключить, что 1 сМ приблизительно эквивалентен 1

миллиону пар нуклеотидов. Такие расчеты, однако, весьма

приблизительны, так как частоты рекомбинации, а значит и

реальная длина одного сМ, могут сильно варьировать в раз-

личных частях генома. Существуют, так называемые, горячие

точки рекомбинации, также как и районы генома, где рекомби-

нация подавлена (центромерные и теломерные участки хро-

мосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др.). Из-

вестно также, что частота рекомбинации у мужчин меньше, чем

у женщин, так что общая длина мужского генома, измеренная в

единицах рекомбинации, составляет лишь 3000 сМ. Таким обра-

зом, генетическое расстояние может дать лишь весьма ориен-

тировочную информацию о физическом (реальном) расстоянии,

выражаемом в парах нуклеотидов.

Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический

анализ, картирование анонимных последова-

тельностей ДНК.

До начала 70-ых годов построение генетических карт че-

ловека продвигалось очень медленными темпами. Небольшой раз-

мер семей, длительный период одного поколения, ограниченное

число информативных родословных и отсутствие методов эффек-

тивного цитогенетического анализа всех пар хромосом затруд-

няло целенаправленное картирование генов человека. Достаточ-

но сказать, что 1-й ген человека - ген цветной слепоты был

картирован на Х-хромосоме в 1911г., а 1-й аутосомный ген-

только в 1968г. К 1973г. на хромосомах человека было карти-

ровано всего 64 гена, а к 1994 на генетических картах чело-

века было локализовано уже свыше 60 000 маркерных ДНК

последовательностей, в том числе около 5 000 структурных

генов - Рис.3.3. Столь стремительный прогресс в картирова-

нии генов человека связан с появлением новых технологий в

цитогенетике, в клеточных культурах и особенно в молекуляр-

ной генетике.

Техника соматической гибридизации, то есть возможность

экспериментального конструирования способных к размножению

межвидовых клеточных гибридов, явилась одним из наиболее

мощных инструментов для нахождения связей между группами

сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и

даже их отдельными сегментами. Гибридные клоны получают пу-

тем искусственного слияния культивируемых соматических кле-

ток разных видов, в частности, клеток человека и различных

грызунов - китайского хомячка, мыши, крысы (Шея,1985).

Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось,

сопровождается утратой хромосом человека. Так были получены

панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну

или несколько хромосом человека и полный набор хромосом

другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфи-

ческих мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах поз-

воляет однозначно определить хромосомную принадлежность

соответствующих генов. Таким способом удалось локализовать

более 250 аутосомных генов человека (Kao, 1983).

Дальнейший прогресс в области генетического картирова-

ния в значительной степени ассоциируется с деятельностью

многих научно-исследовательских центров и лабораторий по

созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее

интересные и обширные родословные. Так, в Центре по Изучению

Полиморфизма Человека (CEPH) (Париж, Франция) была создана

уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур от всех

членов семей, многоступенчатые родословные которых насчиты-

вают многие десятки и даже сотни индивидуумов (CEPH-семьи)

(Todd,1992; Weissenbach et al,1992). Перевиваемые линии кле-

ток получали из первичных культур, трансфорированных вирусом

Эпштейн-Барра, после чего такие лимфобластозные клетки ста-

новятся "бессмертными", то есть могут неограниченно долго

поддерживаться в условиях культивирования. CEPH-семьи

представляют собой идеальные системы для генетического ана-

лиза наследственных признаков. В результате исследования

этих клеточных линий определены генотипы членов CEPH-семей

одновременно по тысячам полиморфных локусов и построены

соответствующие генетические карты. Кроме того, совместными

усилиями многих лабораторий мира были созданы Банки Клеточ-

ных Культур, в которых поддерживаются коллекции лимфоб-

ластозных линий клеток, полученных от членов наиболее инфор-

мативных семей, в которых наблюдается сегрегация по различ-

ным наследственным признакам, в том числе по моногенным за-

болеваниям. Материал этих линий в виде клеточных клонов или

образцов ДНК используется, в частности, для анализа сцепле-

ния сегрегирующих генов с известными генетическими маркерами

или с вновь описанными полиморфными локусами. Таким образом,

во многих случаях при картировании генов человека удается

преодолеть ограничения, связанные с недостатком обширных ин-

формативных родословных.

Наконец, в начале 70-х годов появилась реальная возмож-

ность точной идентификации не только всех хромосом в карио-

типе человека, но и их отдельных сегментов. Это связанно с

появлением методов дифференциального окрашивания препаратов

метафазных хромосом, которые, по сути, произвели революцию в

цитогенетике и хромосомологии. Для получения дифференциаль-

ной окраски хромосомные препараты окрашивают некоторыми флю-

орохромами, либо, после соответствующей протеолитической об-

работки или нагревания, - красителем Гимза. При этом на хро-

мосомах выявляется характерная поперечная исчерченность, так

называемые бэнды, расположение которых специфично для каждой

хромосомы. На метафазных хромосомах малой степени спирализа-

ции идентифицируется около 750 таких полос, на прометафазных

хромосомах 2 500 - 3 000. Следовательно, величина небольших

бэндов на прометафазных хромосомах примерно соответствует 1

сМ на цитогенетических картах или 1 миллиону пар оснований

на физических картах. Такие ориентировочные рассчеты, как

уже упоминалось, оказываются полезными при сопоставлении

масштабов различных генетических карт.

Согласно официально утвержденной номенклатуре

(ISCN,1971) каждая хромосома человека после дифференциальной

окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых

начинается от центромерного района вверх (короткое плечо -

р), либо вниз (длинное плечо - q) (Рис.3.4). Полосы в каждом

сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Крупные

полосы зачастую подразделяются на несколько частей, соот-

ветствующих более мелким бэндам, выявляемым только при ок-

раске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запись по-

ложения гена на цитогенетической карте включает номер хро-

мосомы, плечо, а также номер сегмента, бэнда и его субъеди-

ницы. Например, запись 7q21.1 означает, что ген локализован

в субъединице 1, 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча

хромосомы 7.

Такая подробная запись особенно удобна при использова-

нии для цитогенетического картирования метода гибридизации

in situ (см.Главу I), позволяющего локализовать ген с точ-

ностью до одного бэнда и даже его субъединицы. Основу данно-

го метода, как уже указывалось составляет гибридизация ге-

номной ДНК целых хромосом на разных стадиях их спирализации

с предварительно меченными специфическими ДНК-зондами.

Источником последних могут служить геномные последователь-

ности ДНК, сцепленные с картируемым геном, либо кДНК-овые

последовательности. В настоящее время из тканеспецифических

библиотек генов выделено около 20 000 анонимных последова-

тельностей кДНК, представляющих более 10 000 различных генов

человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют при-

мерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Ме-

тодом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000

генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с по-

лиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирую-

щие последовательности присутствуют на карте генов человека,

но их пока нет на картах сцепления.

Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.

Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неиз-

вестного наследственного признака (гена) в значительной сте-

пени определяется присутствием на карте фланкирующих марке-

ров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе

стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфи-

ческих участков хромосом могут быть использованы любые лока-

лизованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем

легко идентифицируемой популяционной изменчивости или поли-

морфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генети-

ческих маркеров производят по результатам совместного анали-

за их сегрегации в информативных семьях.

Значительные успехи в геномном картировании были связа-

ны с использованием в качестве генетических маркеров широко

распространенной во многих популяциях изменчивости по изо-

ферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие

ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных

стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.

Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются

по специфической активности, но имеют измененную электрофо-

ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов

обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко-

вых систем, контролируемых разными генами, локализованными

во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были

найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти-

фицированы соответствующие группы сцепления.

Совершенствование молекулярных методов анализа специфи-

ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо-

го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай-

тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных

последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы-

ла использована для маркировки участков хромосом с целью

установления более точного взаиморасположения локусов. Вско-

ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были

опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10

до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро-

мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно

для определения хромосомной принадлежности генов, от-

ветственных за любой тип наследственной изменчивости

(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин-

дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех

известных генов на основании анализа сегрегации соответству-

ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре-

деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки

генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-

номерно распределенных полиморфных маркеров.

Идентификация в геноме человека большого числа поли-

морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана-

лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно

повысили возможности локализации неизвестных признаков на

геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000

клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли-

морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-

ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи-

ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени

это анонимные последовательности, связь которых со специфи-

ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего

соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло-

на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая

номенклатура для обозначения используемых в качестве марке-

ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,

что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-

ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-

мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.

Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-

нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-

кая информативность (частота гетерозигот не может превышает

50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение

ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-

шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-

тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК

последовательностей в качестве индексных генетических марке-

ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-

ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-

лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно

распределенных по хромосомам практически завершенаа

(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система

построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.

(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс

простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-

чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-

мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных

на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются

после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более

90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-

ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В

1992г. группе французских ученых под руководством Жана

Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-

мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации

(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из

814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-

нием между ними около 5 сМ, получившую название

Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et

al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000

фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем

ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры

для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-

жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.

Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000

(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих

участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-

дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-

лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-

тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-

держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта

сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-

нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.

Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а

суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%

всего генома человека.

К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до

2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен

до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти-

вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста-

ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру-

ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического

скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих

весь геном человека со средним расстоянием между соседними

маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из

Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни-

ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по-

лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),

причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены

четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково-

го молекулярного веса можно было различить на электрофорег-

рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9

STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо-

ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.

Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим

сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.

Только с помощью одного автоматического сканнера удается

проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в

день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва-

ет самые широкие возможности не только для генетического

картирования и создания подробных карт сцепления практически

любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,

она делает реальной разработку стратегии картирования генов,

мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-

леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,

психозы и многое другое.

Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,

пульсирующий гель-электрофорез.

Используя столь обширную систему молекулярных маркеров

и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур

или на материале информативных родословных можно довольно

быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не

только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-

ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-

посредственно к позиционному клонированию с целью выделения

и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в

картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим

подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-

ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-

мосом и их фрагментов.

Точность цитогенетического картирования определяется

степенью спирализации хромосом, характером использованной

метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-

вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах

и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-

рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35