Литература - Другое (книга по генетике)

числа CpG островков (Табл.2.1). Известно, что в промоторной

области всех генов "домашнего хозяйства" и примерно у 40 %

генов терминальной дифференцировки, обеспечивающих специали-

зированные функции дифференцированных клеток, находятся об-

ласти коротких динуклеотидных CpG повторов. Разработаны мо-

лекулярные методы точной регистрации этих участков, которые

показали, что их число в геноме около 45 000, отсюда число

структурных генов оценивается в 67-70 000 ( Antequera, Bird,

1993). Практически такое же число генов (64 000) определено

недавно методом учета маркерных экспрессирующихся последова-

тельностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).

Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод,

что в геноме человека содержится, в среднем, около 70-80 000

отдельных транскрибируемых ДНК последовательностей, то есть

генов.

Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона,

где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной

гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюда-

ется, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окружен-

ного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами

и интронами имеются консервативные канонические последова-

тельности, играющие существенную роль в обеспечении точности

вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные

последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчива-

ются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорны-

ми и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих

структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная после-

довательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации

первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный

сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с

одного и того же первичного РНК транскрипта.

Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента

РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспе-

чивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и от-

ветственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимера-

за II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно

структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в

ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.

РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспорт-

ных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связыва-

ется с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает

доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами

(Рис. 2.2). После того как первый нуклеотид РНК инкорпориру-

ется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает

продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая

двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот

процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала,

представляющего собой один или несколько терминирующих кодо-

нов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная

спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.

Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное

взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс

контролируется промотором - специальной регуляторной после-

довательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной,

как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под

контролем одного промотора считывается несколько генов c об-

разованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные

области различных генов довольно разнообразны по своему нук-

леотидному составу. Однако, почти для всех промоторов харак-

терно наличие консервативной последовательности из 7 основа-

ний на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации

транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хог-

несса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимера-

зы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 - 80

п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто

расположена другая консервативная последовательность из 9

п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание

РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут су-

щественно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей

области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала

его кодирующей части располагаются другие регуляторные

последовательности, так называемые инхансеры (усилители),

способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличе-

ния скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут

работать независимо от их ориентации по отношению к сайту

инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавля-

ющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (осла-

бители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации

транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать прод-

вижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму

контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция

экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции,

трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти

механизмы более детально рассмотрены в других разделах.

Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-

рикции, ПДРФ-анализ.

Кодирующие и регуляторные области структурных генов на-

иболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в

них подвержены давлению жесткого естественного отбора.

Действительно, небольшие изменения в этих последователь-

ностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция

нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза

белка или к потере его функции, что, как правило, драмати-

ческим образом сказывается на жизнеспособности особей, несу-

щих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека

состоит из некодирующих последовательностей, подобных сател-

литным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным проме-

жуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы

и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или

полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не

оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репро-

дуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных

прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы

являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа

родословных можно проследить их наследование в ряду поколе-

ний, проанализировать сцепление друг с другом, с известными

генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть

использовать в качестве обычных менделевских признаков в

классическом генетическом анализе. Информативность полиморф-

ных локусов определяется уровнем их генетической изменчи-

вости в различных популяциях.

Экспериментально легко выявляются два варианта геномно-

го полиморфизма. Количественые изменения в области локализа-

ции мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и ка-

чественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появ-

лению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае измен-

чивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию

аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого

вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан

с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых,

как правило, в уникальных последовательностях некодирующих

участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генети-

ческого кода (см.Глава 1) могут возникать и в кодирующих

последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в

сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре-

зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом,

при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.

Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хро-

мосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на

300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и исполь-

зован для молекулярной маркировки специфических участков ге-

нома исторически раньше по сравнению с вариабильными сател-

литными повторами (Botstein et al.,1980).

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть

легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагмен-

тов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Ана-

лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы-

ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism

-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном-

ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро-

форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден-

тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест-

рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).

При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо-

реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения

ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот-

ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя

соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо-

нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на

электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам

фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест-

рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С

каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному

локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа-

ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае

возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест-

рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-

тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест-

рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак-

тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в

десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда-

ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по-

лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты

изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию

и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте

ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-

личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли-

ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо-

мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об-

ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в

нижней области геля, соответствующий более короткому фраг-

менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по-

лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в

верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,

тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,

если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер-

жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния

этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп-

лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в

исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента

не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа-

зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области

сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины

(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,

один из которых по длине будет соответствовать размеру амп-

лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же

суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова-

ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож-

ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных

варианта электрофореграмм.

Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по-

лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге-

нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон-

дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной

нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют

широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде-

ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих

собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят

ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име-

ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из

популяций аналогичные исследования проводят в других популя-

циях.

Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции

всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да-

же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге-

терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет

превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного

сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный

аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную

маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по-

лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).

Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.

Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо

более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными

сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель-

ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -

90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых

микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове-

ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они

достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро-

мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто-

ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро-

вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach

et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных

последовательностей различают варьирующие по числу тандемные

повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а

также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко-

полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме

превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,

1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по

числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -

ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с

контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et

al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно-

ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,

можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных

или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно-

типную коровую последовательность. Примером может служить

VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая

четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми

повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с

успехом используются для идентификации личности методом

ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у

двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным

локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно

меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR

найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо-

гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло-

гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В

последнее время многочисленные VNTR- последовательности об-

наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).

Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-

ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по-

мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен-

но удобны для такого скрининга геномные библиотеки,

сконструированные на основе предварительно фракционированных

по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие

фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате-

литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие

результаты были получены также при скринировании космидных

библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и

использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР

(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью

применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага

М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour

etal., 1990).

Одним из вариантов минисателлитных последовательностей

являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы

-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и

также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых

единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы

обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других

частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от

друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20

кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-

и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как

они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR

обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее

время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих

тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых

частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в

сторону их увеличения может приводить к нарушению функции

этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи-

ной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни

экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления ко-

ротких тандемных повторов используют синтетические олигонук-

леотиды, построенные из простых повторов трех или четырех

нуклеотидов.

В последнее время для обнаружения различных классов

микросателлитных последовательностей и STR-повторов применя-

ют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР

(Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое

число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.

Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от

друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35