Литература - Другое (книга по генетике)

родителя этого ребенка являются гетерозиготными носителями

мутантных аллелей соответствующего гена и риск повторного

рождения больного ребенка в такой семье составляет 25%, не-

зависимо от исхода предыдущих родов. Поэтому в таких случаях

рекомендуется обязательная пренатальная диагностика плода

при каждой последующей беременности.

Для сцепленных с полом заболеваний важной практической

задачей является выявление случаев спонтанного возникновения

мутаций в родительском поколении. Для таких распространенных

заболеваний, как миодистрофия Дюшенна и гемофилия А, почти

1/3 всех случаев имеет спонтанное происхождение. При этом

мутации гена дистрофина, как правило, возникают в оогенезе,

то есть у матери, а мутации гена фактора Y111, обычно, появ-

ляются во время сперматогенеза у деда больного ребенка (см.

Главу X). В отличие от тех семей, в которых мать гетерози-

готна, вероятность повторного рождения больного ребенка в

семьях со спонтанной мутацией не превышает среднепопуляцион-

ной частоты, и потому нет необходимости проводить пренаталь-

ную диагностику плода при последующих беременностях. Специ-

ального рассмотрения в этой связи заслуживает,однако, вопрос

гонадного мозаицизма, то есть наличия в гонадах матери гене-

тически нормальных и мутантных ооцитов. Особенно велик риск

такого состояния в случае миодистрофии Дюшенна. Гонадный мо-

зацизм в силу своей органной специфики достаточно трудно до-

казать или опровергнуть. Между тем, считается что 6,7% спо-

радических случаев иодистрофии Дюшенна обусловлена гонадным

мозаицизмом у матери (Essen et al.,1992).

Подробное медико-генетическое консультирование семей, в

которых зарегистрированы спонтанные случаи рождения детей с

Х-сцепленными заболеваниями в сочетании с соответствующими

лабораторными, в том числе и молекулярными исследованиями,

как правило, позволяют ответить на вопрос о происхождении

мутации. Так,гетерозиготное носительство у матери может быть

заподозрено, в частности, по содержанию соответствующих бел-

ковых продуктов (например, фактора Y111 свертывания крови

при гемофилии А; дистрофина в мышцах и креатинкиназы в сыво-

ротке крови при миодистрофии Дюшенна) либо при помощи специ-

альных ДНК-методов, позволяющих идентифицировать мутантный

аллель у матери. Если дифференцировка этих случаев невозмож-

на или доказано, что мутация у больного ребенка не является

спонтанной, следует предпологать, что мать является гетеро-

зиготной носительницей и с 50%-ой вероятностью будет переда-

вать болезнь своим сыновьям. В этом случае пренатальная ди-

агностика обязательна и должна сопровождаться определением

пола плода. Следует, однако, подчеркнуть, что установление

мужского пола плода на сегодняшний день отнюдь не является

показанием для прерывания беременности, поскольку в 50% слу-

чаев они получают от матери X-хромосому с нормальным аллелем

гена и являются вполне здоровыми. Определить, какую именно X

-хромосому (с нормальным или мутантным аллелем) получил бу-

дущий мальчик, и является задачей молекулярной диагностики.

С помощью прямых и непрямых методов ДНК-диагностики эта за-

дача уже практически решается для очень многих сцепленных с

полом заболеваний (см.Главу X).

Наиболее эффективной мерой профилактики наследственных

заболеваний является выявление гетерозиготных носителей му-

таций, так как при этом удается предотвратить рождение пер-

вого больного ребенка в семьях высокого риска. Родственники

больного с большой вероятностью могут быть гетерозиготными

носителями мутантных аллелей, поэтому в тех случаях, когда

это возможно, они подлежат обследованию в первую очередь.

Для болезней, сцепленных с полом, это родственники по женс-

кой линии - сестры, дочери и тетки пробанда. Их диагностика

особенно важна, так как вероятность рождения больных сыновей

в потомстве носительниц мутаций очень высока и не зависит от

генотипа супруга. При аутосомно-рецессивных заболеваниях по-

ловина сибсов родителей и 2/3 здоровых сибсов больного будут

гетерозиготными носителями мутации. Поэтому в тех семьях,

где принципиально возможна молекулярная идентификация му-

тантных аллелей, необходимо обследовать максимальное число

родственников больного пробанда для выявления гетерозиготных

носителей. Иногда в больших семьях с разветвленными родос-

ловными удается проследить наследование неидентифицируемых

мутаций с помощью косвенных методов молекулярной диагности-

ки.

Для заболеваний, распространенных в определенных попу-

ляциях или в каких-то этнических группах и обусловленных

присутствием одного или нескольких преобладающих и легко

идентифицируемых мутантных аллелей, возможно проведение то-

тального скрининга на гетерозиготное носительство этих мута-

ций среди определенных групп населения, например, среди бе-

ременных женщин или среди новорожденных. Считается, что по-

добный скрининг экономически оправдан в том случае, если при

проведении процедуры выявляются аллели, составляющие не ме-

нее 90 - 95 % всех мутаций данного гена в исследуемой попу-

ляции. Выявленные при подобных обследованиях носители мута-

ций также составляют группу риска, и в последующем должны

быть аналогичным образом протестированы их супруги. Однако,

даже в том случае, если мутация найдена только у одного из

родителей, вероятность рождения больного ребенка несколько

выше популяционной частоты, но, конечно, значительно меньше

25%. Конкретное значение этого риска зависит от общей часто-

ты мутаций соответствующего гена в популяции. В таких семьях

по желанию родителей также может быть проведена пренатальная

диагностика и прослежено наследование мутантного аллеля. При

отсутствии этой мутации у плода прогноз считается благопри-

ятным, независимо от того, какие аллели ребенок получит от

второго супруга.

Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов

в пренатальной диагностике моногенных болез-

ней.

Следующим шагом после отбора нуждающейся в пренатальной

диагностике семьи является комплексное молекулярное обследо-

вание ее членов - родителей и, если есть такая возможность,

больного ребенка. Эти исследования могут быть достаточно

длительными и поэтому желательно их проводить до наступления

беременности. Результаты молекулярного обследования семьи

служат основой для назначения и выбора способов проведения

пренатальной диагностики. После этого семья планирует бере-

менность, и в определенные сроки женщина поступает в клинику

для проводения процедуры, обеспечивающей забор необходимых

для диагностики тканей плодного происхождения. При этом сле-

дует учитывать, что определение конкретных сроков этой про-

цедуры зависит от многих медицинских показаний (в превую

очередь, акушерских), обеспечивающих максимальную безопас-

ность подобного инвазивного вмешательства как для матери,

так и для будущего ребенка (Баранов и др.,1994; Бара-

нов,1994).

Наиболее объективная информация о наличии моногенного

наследственного заболевания у плода может быть получена при

анализе его ДНК и обнаружении мутационных изменений в коди-

рующих или регуляторных последовательностях соответствующих

генов. Практическая диагностика мутантных аллелей в семьях

высокого риска проводится для заболеваний с известным спект-

ром наиболее часто встречающихся мутаций. При этом для каж-

дой болезни разрабатываются относительно простые и наиболее

эффективные методы идентификации мутантных аллелей. В насто-

ящее время насчитывается уже несколько сотен таких заболева-

ний и количество их быстро увеличивается (Baranov,1993; Ба-

ранов,1994; см.Главу X).

Для генотипирования мутаций, то есть для выяснения при-

роды мутантных аллелей у больного и его родителей использу-

ются различные стандартные методы, подробно изложенные в

главе IV. Выбор конкретного метода зависит от типа предпола-

гаемых мутаций и от методических возможностей диагностичес-

ких центров. При отсутствии у пробанда наиболее частых и ра-

нее описанных мутаций его ДНК может быть направлена в специ-

ализированные молекулярно- генетические лаборатории для бо-

лее тщательного анализа с использованием всего комплекса ме-

тодов идентификации мутаций вплоть до получения и секвениро-

вания мутантных кДНК- вых последовательностей гена. Однако,

подобные исследования очень дороги, требуют много труда и

времени и потому в обычной клинической практике используются

достаточно редко. В этих случаях чаще прибегают к косвенным

методам молекулярной диагностики (см. раздел 7.1). Для мно-

гих заболеваний, эти методы все еще остаются единственно

возможными (см.Главу X). Однако, как уже указывалось, они

требуют обязательного обследования полной семьи, включая

больного ребенка. При его отсутствии молекулярное маркирова-

ние мутантных генов у гетерозиготных родителей становится

невозможным, а, следовательно, невозможна и пренатальная ди-

агностика.

Идентификацию мутантных генов осуществляют путем срав-

нения маркерных генотипов родителей и больного ребенка. Если

не произошел кроссинговер между маркерным локусом и геном,

все больные дети в семье должны иметь одинаковый маркерный

генотип. Поэтому при проведении пренатальной диагностики

сходство генотипов плода и пробанда является необходимым,

однако в ряде случаев, вовсе не достаточным условием для

подтверждения наличия заболевания. Так, например, у гомози-

готных по маркеру родителей все дети будут иметь одинаковый

генотип по этому локусу независимо от присутствия мутантных

аллелей гена. Необходимым условием дифференцировки нормаль-

ных и мутантных генов у носителей мутаций является их сцеп-

ление с разными аллелями маркерного локуса. Поэтому, дискри-

минация мутантных генов у родителей возможна только с по-

мощью гетерозиготных маркеров. При этих условиях мутантные

гены родителей могут быть определены по тем маркерным алле-

лям, которые присутствуют у больного ребенка. Однако, иден-

тификация по маркерным аллелям обоих мутантных генов возмож-

на лишь в тех случаях, когда родители гетерозиготны, а про-

банд (больной) гомозиготен по маркерному локусу.

Возможность идентификации мутантных генов родителей на

основе анализа маркерных генотипов определяет информатив-

ность семьи по отношению к данному маркеру. На Рис.7.1

представлены возможные маркерные генотипы в полностью и час-

тично информативных, а также в неинформативных семьях при

определении их путем блот-гибридизации с ДНК-зондом. Анало-

гичные схемы могут быть составлены и в тех случаях, когда

маркерные генотипы определяются путем анализа содержащих по-

лиморфные локусы амплифицированных фрагментов ДНК. В инфор-

мативных семьях маркерный генотип больного ребенка отличает-

ся от маркерных генотипов обоих родителей и здорового сибса,

поэтому можно проследить наследование мутантных генов при

каждой беременности. В этом случае сходство маркерных гено-

типов пробанда и плода достаточно для неблагоприятного прог-

ноза, а носители мутации будут иметь родительский генотип. В

частично информативных семьях идентифицируется только один

из мутантных генов, так как маркерный генотип больного ре-

бенка совпадает с генотипом одного или даже обоих родителей.

В этом случае при сходстве маркерных генотипов плода и про-

банда вероятность болезни будущего ребенка составляет 50%.

Все дети с другим маркерным генотипом будут здоровы, но по-

ловина из них будет нести один из мутантных аллелей. Неин-

формативный маркер не пригоден для идентификации мутантных

генов, а следовательно, и для проведения молекулярной диаг-

ностики в данной семье. При отсутствии полной информативнос-

ти необходимо исследовать другие сцепленные с геном поли-

морфные локусы и выбрать в качестве маркеров те из них, ко-

торые у родителей пробанда находятся в гетерозиготном состо-

янии. В частично информативных семьях можно проводить прена-

тальную диагностику с такой же степенью достоверности, как и

в полностью информативных семьях, при одновременном исполь-

зованием двух полиморфных локусов, каждый из которых марки-

рует разные мутантные гены обоих родителей. Информативными

оказываются также те семьи, в которых один из мутантных ал-

лелей может быть идентифицирован прямым анализом соответс-

твующего участка гена, а наличие другого мутантного аллеля

доказывается с помощью маркерного локуса. Для многих моно-

генных наследственных заболеваний количество идентифициро-

ванных высокополиморфных локусов, тесно сцепленных с контро-

лирующим геном, достаточно для того, чтобы более 90% семей

высокого риска оказались полностью информативными, а значит,

пригодными для проведения в них пренатальной диагностики с

использоваанием молекулярных методов тестирования состояния

плода.

Таким образом, при отсутствии возможности прямой иден-

тификации соответствующих мутантных аллелей, анализ информа-

тивности семьи следует начинать с наиболее полиморфных мар-

керных локусов. так как при этом больше вероятность того,

что родители больного ребенка окажутся гетерозиготами по

выбранному маркеру. При последующем выборе маркеров важно

также учитывать наличие между ними неравновесности по сцеп-

лению, так как чаще всего информативность семей в отношении

маркеров, находящихся в сильном неравновесии по сцеплению,

будет одинакова. Действительно, неслучайный характер цис- и

транс-расположения аллелей в неравновесных по сцеплению ло-

кусах обуславливает повышенную вероятность таких событий,

при которых гомозиготы по одному из маркеров оказываются го-

мозиготными и по другому. То же самое справедливо и в отно-

шении гетерозигот. Поэтому при анализе информативности

семьи, в первую очередь, следует выбирать маркерные локусы,

находящиеся между собой в равновесии по сцеплению.

Следует также учитывать, что определенные аллели поли-

морфных сайтов, расположенных близко к мутации, возникшей

однократно много лет назад и распросранившейся в популяции,

будут оставаться в очень тесном неравновесии по сцеплению.

Примером может служить неравновесность между delF508 (ориен-

тировочный возраст возникновения 30-50 000 лет) и 6-ти член-

ным тетрамерным повтором TAGG в интроне 6 гена муковисцидоза

(Chebab et al., 1993; Агбанглы и др., 1994). Поэтому в семь-

ях высокого риска с большой долей вероятности, конкретное

значение которой определяется детерминантом неравновесности

по сцеплению, гомозиготы по этому маркерному аллелю, окажут-

ся также гомозиготами и по мутации, то есть будут больны.

Конечно, пренатальный диагноз не может быть основан только

на этой информации, однако, её следует учитывать при выра-

ботке комплексного заключения относительно здоровья будущего

ребенка.

Во всех случаях при использовании косвенных методов мо-

лекулярной диагностики необходимо также помнить, что маркер-

ный генотип плода определяет наличие мутантных генов с точ-

ностью до вероятности кроссинговера между мутантным аллелем

и маркерным локусом. Поэтому, чем ближе расположен маркер по

отношению к мутантному аллелю, тем меньше вероятность ошибки

при проведении пренатальной диагностики. Для того чтобы пол-

ностью избежать или, по крайне мере, резко снизить вероят-

ность такой ошибки, желательно использовать внутригенные

маркеры или проводить одновременное тестирование ДНК плода с

помощью двух маркерных локусов, фланкирующих мутантный ал-

лель. Последний подход особенно оправдан при работе с очень

протяженными генами ( например геном дистрофина длиной около

2,2 миллионов пар оснований), где вероятность внутригенного

кроссинговера по некоторым данным может достигать 2-2,5%.

Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-

нозирования.

Следует подчеркнуть, что общий подход к молекулярному

тестированию, практически, не зависит от формы нозологии,

так как для анализа генов и мутантных аллелей используется

один и те же методы (см. Глава IV). При наличии у больного

или у его родителей идентифицируемых мутаций или при нахож-

дении информативных для данной семьи ДНК-маркеров проведение

пренатальной диагностики становится возможным на любой ста-

дии развития и при любом сроке беременности.

ДНК-диагностика на начальных этапах развития человека,

безусловно, имеет свои методические особенности и тесно соп-

ряжена с приемами экстракорпорального оплодотворения и

трансплантации зародышей. Эти обстоятельства позволяют выде-

лить ее в самостоятельное научно-практическое направление -

доимплантационную диагностику генных и хромосомных болезней

(Verlinsky, Kuliev, 1993). Несмотря на очевидные успехи в

этой области, достигнутые в ряде зарубежных лабораторий (до-

имплантационная диагностика муковисцидоза, некоторых X-сцеп-

ленных заболеваний - миодистрофии Дюшенна, синдрома ломкой X

-хромосомы, гемофилии), данное направление исследований все

еще находится на уровне научных разработок и не имеет широ-

кого применения. Объектом ДНК-диагностики на этих стадиях

развития могут служить полярные тельца овулировавших яйцек-

леток и отдельные бластомеры зародыша, полученные методом

микрургии (Рис.7.2). Недостатком этого подхода является

сравнительно невысокий процент (до 30%) приживаемости опери-

рованных зародышей после их искусственной трансплантации в

матку. Подробно с методами доимплатационной диагностики, её

современным состоянием и перспективами можно ознакомиться в

уже цитированной монографии (Verlinsky, Kuliev, 1993). Есть

определенные основания считать, что в связи с быстрым ростом

числа центров экстракорпорального оплодотворения в Рос-

сии, заметным увеличением эффективности их работы, оценивае-

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35