Литература - Другое (книга по генетике)

клинические испытания генокоррекции этого заболевания нач-

нутся уже в ближайшем будущем.

10.4.4 Гемофилия B.

Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызван-

ное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента

средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок

(фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных

остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо-

лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фак-

тор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х по-

липептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно

связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX

циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не

произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего

пептида, что позволяет ему принять конформацию активной се-

риновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с ак-

тивацией фактора X посредством взаимодействий с ионами каль-

ция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.

Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образо-

ванием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высо-

кая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.

Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возни-

кают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et

al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от

отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изо-

лированном случае вероятность гетерозиготного носительства

мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая

корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от

него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в

момент рождения дочери - носительницы новой мутации, состав-

ляет около 42 лет (King et al.,1992).

К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене ге-

мофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеоти-

дов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию

стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы-

раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной

частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встрети-

лась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG

динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота

G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в

других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG

динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии

(A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание

(G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema

et al., 1991).

В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофи-

лии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяжен-

ности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или

акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты

сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена

произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5

(Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промо-

торной области гена F9. Именно с такими мутациями связана

Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к воз-

расту половозрелости наступает улучшение многих клинических

показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.

Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут

приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на

стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного

ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству

транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.

Гемофилия B была использована как модель для выработки

стратегии генетического консультирования при моногенных за-

болеваниях, обладающих выраженной мутационной гетероген-

ностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии яв-

ляется составление национальных баз данных молекулярных де-

фектов и специфических методов их диагностики. В частности,

основываясь на подобной информации, авторы провели характе-

ристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с

гемофилией B шведского и английского происхождения и только

в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как

непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно-

вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:

Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма

в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в

положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у

60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин

и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли-

фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей

детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection

(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации

(Montadont et al.1990).

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко-

вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных

биологических моделей способствовали быстрому прогрессу

исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее

время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-

ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в

опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных

системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве-

дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в

первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали

экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.

После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы-

шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся

в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et

al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена

трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком-

бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При

этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение

более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер-

тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об

успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным

мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич-

ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo

рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный

скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа-

листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи-

лии В - событие самого ближайшего будущего.

10.4.5 Болезнь Виллебранда.

Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некото-

рых формах рецессивное) заболевание, обусловленное

наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору

VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как

фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру-

ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК

составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров

с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.

Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосу-

дов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах поврежде-

ния эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции син-

теза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фак-

тора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и

III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концент-

рация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.

Генетически эта форма заболевания подразделяется на ре-

цессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессив-

ны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора

VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать

большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении ско-

рости их выведения из плазмы (тип IIB).

Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов,

размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величи-

на интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000

пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются

первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица

VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35

экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся после-

довательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA

повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены,

кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На

хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб,

соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,

1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс му-

тации препятствуют образованию функционального транскрипта.

Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II

болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены

аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций

в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,

1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA

кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован

сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе

IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитар-

ным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая

группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сег-

менте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного

изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях.

При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи-

лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма-

лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с

фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру-

ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую-

щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС

(Mazurier, 1992).

Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо-

левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.

Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози-

готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в

одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом

же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки

считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци-

тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута-

ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон

Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов-

ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде

с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между

геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо-

лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра-

вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг-

ностики и результатами медико-генетического консультирова-

ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле-

дования заболевания в семье высокого риска и установить его

форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,

а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа-

ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с

тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве-

ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются

экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et

al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не

обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся

(Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспек-

тивной на современном этапе представляется непрямая диаг-

ностика. В промоторной части гена, в интронах

15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти-

фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с

достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек-

тивным для диагностики является полиморфизм интрона

40, представляющий собой две области варьирующих по числу

тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика-

ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с

последующим электрофоретическим разделением позволяет иден-

тифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма

(Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволя-

ет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому

(ген) и проследить её передачу в потомстве.

Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступ-

ной литературе не обнаружены.

10.4.6 Фенилкетонурия.

Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосом-

но-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным де-

фектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии

своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Ев-

ропе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -

17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ

достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).

Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России

частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.

Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевремен-

ном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин,

умственная ограниченность, как правило, не развивается или

имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скрини-

рующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.

Гидроксилирование фенилаланина является достаточно

сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3

фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фер-

мент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД,

продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фе-

нилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению

фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может

возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при

дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и

сопровождаются снижением активности РАН, значительно отлича-

ются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной

фенилаланина.

PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием

мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций

- однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах

сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом

транзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.

Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется не-

большой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный

характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et

al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается

в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок

связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дупле-

тов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район лока-

лизации делеций - экзоны 1, 2 и 3.

Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сай-

тов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим мар-

керам среди представителей разных рас и этнических групп

значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по

сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гапло-

типами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и

наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоцииро-

вана только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рест-

рикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная

в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в до-

норном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella

et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -

R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в част-

ности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Ки-

тае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в

Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее

частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Тур-

ции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к

9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплоти-

пами 6, 10 и 36.

Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморф-

ным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популя-

циях, национальностях и этнических группах позволяет сделать

вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже

после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена

РАН в различных популяциях и этнических группах связано с

эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз-

никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет

тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не

может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с

демографической историей. Несомненно доказанными являются

примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных

популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие попу-

ляционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны,

по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с сущест-

вованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и

с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что

носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к

токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторы-

ми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), раз-

вивающимися при хранении зерна и других продуктов

(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гете-

розиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность абор-

та, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно,

высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может

быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран,

способствующем росту таких грибов.

В медицинской практике используется как прямая, так и

косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35