| |||||
МЕНЮ
| Литература - Другое (книга по генетике)метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити- дина. Экспериментальное изучение характера метилирования основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую- щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того, находится ли это основание в метилированном состоянии или нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после- довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля- ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили- рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' - сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3' последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные индивидуумы, независимо от их этнического происхождения, практически не различаются по характеру метилирования ДНК в одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене- тической дифференцировки происходят значительные изменения рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу- холевого происхождения число метилированных сайтов резко уменьшено. Высказано предположение о наличии прямой связи между метилированием ДНК и состоянием генетической активности в клетках. Существует класс белков, которые специфическим об- разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз- можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен- тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив- ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде- тельствует о функциональной активности генов. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа- ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети- лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са- мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге- номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба- ранов, 1991). В GC-богатых изохорах локализовано большое количество CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха- рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина (G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован- ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986; Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80% Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило, CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь- ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки- пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв- ляются характерной особенностью транскрибируемых участков генома. Их идентификация в клонированных последовательностях геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9, 15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр- ные методы регистрации СрG островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45000 ( Antequera,Bird,1993). Можно также отметить существование в геноме человека сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур- но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та- ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви- димому, это необходимое, но не достаточное условие их экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме- няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко- торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион- ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи- тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа- ях это области функционально активных генов, находящихся в деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру. Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви- тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро- мосомных препаратах визуализировать функционально активные районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба- тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по- мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече- ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно только в те участки хромосом,где находятся функционально ак- тивные гены (Verma, Babu, 1989). ГЛАВА YIII. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА. Раздел 8.1. Генетические линии животных. Большая роль в исследовании проблем генетики челове- ка и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей (Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирую- щими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных генов млекопитающих и человека, а также наличие большого числа консервативных групп сцепления с идентичным расположе- нием генов наряду с возможностями использования очень мощных экспериментальных подходов для идентификации и клонирования генов линейных животных позволяют проводить параллельные исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека. Для многих моногенных заболеваний человека животные, несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а зачастую и единственными моделями для исследования молеку- лярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лече- ния, в том числе и с применением методов генной терапии (см.Главу IX). Поиск таких биологических моделей, прежде всего, ведется, среди уже существующих генетических линий животных с установленным типом наследования определенных аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является до- казательство идентичности мутантных генов и, соответственно первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных животных. В различных питомниках мира, в том числе и в России, созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков до несколько сотен генетических линий различных эксперимен- тальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Коню- хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее мно- гочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости, удобства содержания, относительной легкости эксперименталь- ного манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые из этих линий представляют собой случайные находки, другие, а их большинство, получены в результате действия различных мутагенных факторов. Так, значительное число биологических моделей было получено путем биохимической селекции потомства мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз- мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия, почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ полу- чения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой слу- чайности и не позволяет направленно менять структуру нужного гена. Процесс создания подобных генетических линий обычно включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ наследования этих фенотипческих признаков; длительное близ- кородственное разведение отселектированных особей. При моно- генном наследовании такие линии могут либо целиком состоять из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерози- готных особей в случае сниженной жизнеспособности и наруше- ния плодовитости у гомозигот. На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо моногенного наследственного заболевания руководствуются сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом мутантных животных. Однако, одного этого сходства недоста- точно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть дока- зать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические из- менения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследу- ются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели наследственных болезней известны и достаточно полно изучены для многих других экспериментальных и домашних животных. Представляется удивительным, что, несмотря на большое сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первич- ной структуре и тождественных по функциям структурных генов, для значительной части наследственных болезней человека ге- нетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Ко- нюхов, 1969). Это ограничение в настоящее время может быть преодалено путем целенаправленного конструирования генетических модель- ных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990; Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволо- вых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генет- ческим изменениями и пересадку их в зародыши или в сомати- ческие ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных ге- нов in vivo и оценки их биологического действия особенно удобными оказались трансгенные животные. Раздел 8.2. Трансгенные животные. Трансгенных животных получают в результате искусствен- ного введения - трансгеноза, чужеродного генетического мате- риала, представляющего из себя фрагмент гена или иную после- довательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными экспериментальными системами для исследования молекуляр- но-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чуже- родного гена, оценки его биологического действия на орга- низм, а также для производства различных манипуляций со спе- цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколь- ко способов получения трансгенных животных. Исторически бо- лее ранним и широко применяемым до настоящего времени явля- ется микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро опло- дотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи мик- романипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцек- летки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дроб- ления случайным образом интегрирует в один из сайтов ка- кой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента. При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различ- ных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интег- рация может происходить в разные хромсомные сайты и число интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может зна- чительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку транспланти- руют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что по- добный механический вариант трансфекции чужеродных генов на ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным. Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, ис- пользуя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрес- сию введенного гена анализируют путем идентификации специфи- ческих мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в раз- личных тканях трансгенного животного. Другой, более более прогрессивный способ получения трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвер- гается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые клетки (см.ниже), которые затем трансплантируют в полость бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преи- мущества в плане генетического моделирования подробно рассмотрены в разделе 8.4. Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хро- мосому образует блок из множества тандемно расположенных ко- пий, при этом число единиц повтора в блоке у разных особей может варьировать от единицы до нескольких сотен. После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генети- ческие конструкции устойчивы и стабильно передаются по- томству в соответствии с законами Менделя. Встраивание вве- денной ДНК в функционально значимые области генома может приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом, животные, полученные при введении одного и того же гена, бу- дут различаться как по сайтам интеграции, так и по количест- ву копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях, по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций. Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле уникально. Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обь- ектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введен- ного гена у животных, различающихся по длине фланнкирующих последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность об- наружить элементы гена, контролирующие его работу в разных типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последова- тельностей гена часто вводят генетические конструкции, соче- тающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого выражается в появлении известной и легко определяемой фер- ментативной активности. Использование для трансгеноза реком- бинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комби- нации регуляторных элементов и кодирующих последовательнос- тей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механиз- мов активации генов в разных типах тканей. Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже- родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк- лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с уже известными наследственными нарушениями у человека и по- добные животные также могут использоваться в качестве гене- тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре- нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи- ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо- вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно (Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до- полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше- нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс- твие этого, было причиной патологических процессов. Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование. Другой вариант биологического моделирования основан на получении животных с определенными очень специфичными, но ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько примеров подобного экспериментального моделирования. Описанная технология трансгеноза (введение генов в про- нуклеус) может быть использована, в частности, для направ- ленного получения животных с избирательными дефектами (уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает- ся в возможности селективной элиминации тех специфических типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа- щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий- ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде- ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива- ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз- вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая система действует как очень точный скальпель. Дальнейшая модификация метода заключается в использова- нии для трансгеноза условно летального гена, каким является, Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 |
ИНТЕРЕСНОЕ | |||
|