| |||||
МЕНЮ
| Литература - Другое (книга по генетике)агностики и в практической медицине мы чаще всего имеем дело только с теми мутациями, которые не проявляют летального эф- фекта на ранних стадиях эмбрионального развития. Тем ни ме- нее, не исключено, что ранние эмбриональные летали составля- ет немалый процент среди мутантных аллелей различных генов и вносят определенный вклад в снижение репродуктивной функции. Особого внимания заслуживает проблема мутирования в STR-сайтах и в VNTR- локусах, часто используемых в настоящее время для геномной дактилоскопии и молекулярной диагностики. Эти участки генома, изменчивость в которых обусловлена раз- личиями в числе тандемных повторов, формально можно отнести к разряду высокомутабильных. Заметим сразу, однако, что пря- мое сопоставление темпов мутирования в кодирующих областях генома и в мини- и микросателлитных последовательностях ДНК, по-видимому, некорректно, так как физическая основа изменчи- вости, наблюдаемой в этих функционально и структурно разли- чающихся локусах совершенно различна. Мутабильность в STR-сайтах обусловлена нестабильностью числа повторов, при- чем возникающие мутации затрагивают, как правило, лишь весь- ма ограниченное число кластерированных копий, чаще всего 1 или 2. Подобные тандемные повторы редко наблюдаются в смысловых последовательностях ДНК. Исключение составляют лишь мутации экспансии, но и для них характерно (1) сущест- вование большого числа аллелей дикого типа, отличающихся друг от друга небольшим числом копий, и (2) значительные различия по длине повторяющегося участка между нормальными и мутантными вариантами гена. Кроме того, изменчивость в STR-сайтах в основе своей носит нейтральный характер и пото- му темп мутирования в этих локусах не подвержен жесткому контролю со стороны естественного отбора. Прямые исследования показали, что в большинстве случаев частота возникновения спонтанных мутаций в микросателлитных STR -сайтах варьирует в пределах от 0.1% до 0.45% на гамету, что должно учитываться при использовании этих маркеров в практической медицине. Частота мутирования в вариабильных (C-A)n -повторах, используемых в качестве индексных маркеров в Genethon - картах сцепления составляет 0.05% на гамету. Показано, что для ряда VNTR-локусов (MSB2) частота мутирова- ния достигает 0.7% на гамету. Для других локусов (М17) обна- ружено достоверное превышение скорости мутагенеза в зароды- шевых клетках по сравнению с соматическими. Для многих достаточно стабильных STR-локусов обнаружены существенные межпопуляционные различия по частоте аллелей, что позволяет использовать эту изменчивость для генетической характеристи- ки отдельных популяций. В то же время другие STR-сайты зна- чительно чаще подвергаются спонтанному мутированию, что при- водит к уравновешиванию паттерна аллелей и делает эти марке- ры малопригодными для популяционных исследований. Имеются данные, что в наиболее вариабильных STR-локусах частота спонтанных мутаций может достигать 5% на гамету за поколение (Jeffreys et al., 1988). Раздел 5.3. Эндогенные механизмы возникновения мутаций. Основную часть мутаций, ведущих к наследственным болез- ням, составляют точечные мутации, делеции и в меньшей степе- ни инсерции и дупликации. При этом, как показывает детальный сравнительный анализ, частота, тип и локализация этих мута- ций отнюдь неслучайны и зависят от многих, пока еще невы- ясненных эндогенных механизмов мутагенеза. В пользу такого вывода свидетельствует уникальный характер спектра мутаций для каждого из многих десятков генов, первичная структура ДНК и типы мутаций которых уже хорошо изучены. Так, для мно- гих структурных генов доминирующими по спектру и частоте яв- ляются точечные мутации (ген трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза, ген фенилаланингидроксилазы, ген факто- ра IX cвертывания крови, бета-глобиновый ген и мн др.), тог- да как для других - достаточно протяженные структурные пе- рестройки типа делеций, дупликаций и инсерций (гены дистро- фина, фактора VIII свертывания крови, 21-гидроксилазы) (см.Главу X). К структурным факторам, определяющим эндоген- ные механизмы мутагенеза, можно отнести (1) наличие прямых и обратных повторов и симметричных элементов вблизи места пе- рестройки; (2) высокую концентрация СpG динуклеотидов; (3) наличие внегенных последовательностей ДНК, гомологичных фрагментам структурного гена; (4) мобильные элементы генома. Естественно, что реализация этих структурных факторов в те или иные типы мутаций возможна лишь в процессе репликации (1,2) и рекомбинации (3) ДНК хромосом. Как подробно рассмотрено в серии работ D.N Cooper и M.Кrawczak (1990, 1991), наличие в первичной структуре ДНК прямых повторов, идентичных повторяющихся последователь- ностей, инвертированных повторов, шпилечных структур, квази- палиндромных последовательностей и симметричных элементов генома (например CTGAAGTC) нередко ведет к образованию пе- тель при репликации ДНК вследствие скользящего нарушения спаривания (slipping mispairing) родительской и дочерней це- пей ДНК. Эти новые структурные элементы ДНК либо уничтожа- ются ферментами системы репарации, что ведет к делециям, ли- бо сохраняются и дублируются, что приводит к дупликациям и инсерциям, при этом возникшие изменения закрепляются при последующих раундах репликации. Авторы приходят к следующим выводам: (1) возникновение подобных мутаций происходит неслучайно, но зависит от особенностей первичной структуры ДНК в месте перестройки; (2) в основе структурных перестроек ДНК лежат ошибки репликации; (3) принципиально сходные моде- ли эндогенного мутагенеза характерны как для делеций, так и для инсерций. Считается, что именно механизм скользящего на- рушения спаривания ответственен за мутации экспансии, приво- дящие к быстрому увеличению числа тринуклеотидных повторов и к нарушению работы соответствующих генов, а также за высокую изменчивость, наблюдаемую во многих местах локализации мини- и микросателлтных тандемных повторов. Недавно показано, что повышенной эндогенной мутаген- ностью обладают вообще все последовательности ДНК, находящи- еся в определенном конформационном состоянии, а именно в состоянии изгиба (bent DNA) (Milot et al.,1992). Известно, что такая конформационная структура ДНК свойственна промо- торным частям генов, местам начала репликации (origins of replication), местам контакта хромосом с ядерным матриксом. Именно эти участки ДНК являются местами посадки ферментов топоизомераз, вовлеченных в процессы репликации, транскрип- ции, рекобинации, в том числе, как оказалось, и в процесс негомологичной (незаконной -illegitimate) рекомбнации. Уста- новлено, что именно негомологичная рекомбинация может приво- дить не только к внутригенным делециям, дупликациям и другим мутациям на молекулярном уровне, но и является одной из основных причин крупных структурных хромосомных перестроек типа транслокаций, инверсий и других. Замены или утраты отдельных оснований в геномной ДНК могут возникать в результате нарушения процессов репликации и репарации. Ошибки в ДНК матрице, вызванные действием пов- реждающих внешних агентов, либо спонтанной деградацией осно- ваний закрепляются в последующих циклах репликации. Основные типы спонтанной деградации включают потерю оснований и про- цесс дезаминирования. Особенно чувствительны к дезаминирова- нию цитозиновые остатки. Установлено, что у позвоночных поч- ти половина всех цитозиновых остатков в ДНК метилирована в 5-ом положении. Процесс метилирования особенно часто захва- тывает области повторов 5'CpG 3', расположенные как внутри генов, так и в их промоторных частях. При дезаминировании 5-метилцитозин превращается в тимин. В цикле последующей репликации, возникший в результате дезаминирования мисмэтч (T-G) может либо коррегироваться в нормальный вариант (С-G), либо приводить к мутациям типа трансцизий (Т-G) или (С-А). Естественно, что гены, имеющие в своей структуре большой процент CpG оснований, особенно часто подвергаются спонтан- ному мутированию типа трансцизий. В частности, преобладание подобных точечных мутаций известно для генов факторов IX и VIII свертывания крови, для гена фенилкетонурии и других. Так, из 76 мутаций гена фактора IX в 21 случае найдены трансцизии CpG - TpG или СрА (Green et al.,1990). Преоблада- ние таких мутаций отмечено и в 22 CpG дуплетах гена фенила- ланингидроксилазы у больных фенилкетонурией (Abadie et al.,1989). Другим важным фактором эндогенного мутагенеза является наличие тесно сцепленных с генами гомологичных последова- тельностей ДНК (псевдогенов). В мейозе такая ситуация неред- ко приводит к неравной гомологичной рекомбинации и, как следствие этого, к генной конверсии, сопровождающейся струк- турными перестройками типа делеций, дупликаций и т.п. Подоб- ный механизм мутаций, как оказалось, является доминирующим для гена 21-гидроксилазы (Morel, Miller,1991), а также для гена фактора VIII свертывания крови (Lakich et al.,1993). Важная роль ошибок рекобинации в этиологии структурных поло- мок гена особенно очевидна при анализе гена дистрофина, му- тации которого ведут к миопатии Дюшенна. Известно, что в 60% случаев мутации этого гена представляют собой делеции, зах- ватывающие один или несколько соседних экзонов. Известно также, что подавляющее большинство делеций сосредоточено в двух "горячих" районах этого гигантского по размерам гена (2,2 Мб), и при этом частота внутригенных рекомбинаций почти в 4 раза больше, чем можно предполагать, исходя из его раз- меров (Oudet et al.,1992). Любопытно отметить, что в одной из этих горячих точек (интрон 7) недавно обнаружен кластер транспозоноподобных повторяющихся последовательностей. Удельный вес мобильных (транспозонподобных) элементов типа Alu и Line повторов (см. Главу 2) в возникновении генных му- таций до конца не выяснен. Имеются единичные наблюдения о реальном перемещнии этих элементов по типу конверсии и их интеграции в структурные гены аденозиндезаминазы, аполипоп- ротеина С, факторов VIII и IX свертывания крови, кальмодули- на (Vidaud et al.,1993). Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му- таций в популяциях. Частоты и характер распределения мутаций в популяциях зависят от многих факторов, главными из которых являются частоты мутагенеза и давление естественного отбора. Значи- тельное влияние на этот процесс оказывают также структурные особенности популяций, такие как размеры, степень географи- ческой и этнической изолированности, величина инбридинга, характер миграции населения. Для всех мутаций, возникающих за счет повышенного уров- ня спонтанного мутагенеза, характерны следующие особенности - неслучайный характер внутригенной локализации мутаций, сходство типов нарушений при отсутствии полной молекулярной идентичности между ними. В отличие от спонтанных мутаций, вызыванных эндогенными причинами, для мутаций, индуцирован- ных действием неблагоприятных факторов внешней среды, про- мышленными и сельскохозяйственными вредностями, ионизирующим облучением, химическими агентами и прочим, специфики в типах мутаций и в характере их локализации не наблюдается. В попу- ляциях, находящихся в области действия таких неблагоприятных факторов, будет повышена частота мутаций в различных генах, однако спектр индуцированных мутаций будет достаточно разно- образным. Рассмотрим теперь влияние отбора на процесс поддержа- ния и распространения мутаций в популяциях. Многие гены мо- ногенных наследственных заболеваний рецессивны, то есть му- тации в них в гетерозиготном состоянии не оказывают вредного влияния на жизнеспособность. Поэтому после возникновения му- тация может распространяться в популяции до определенной концентрации, практически не подвергаясь элиминирующему действию естественного отбора. В дальнейшем частота этой му- тации достигнет равновесного состояния и не будет повышаться за счет выщепления гомозиготных особей, жизнеспособность и репродуктивные качества которых резко снижены. При этом ско- рость элиминации мутации из популяции резко замедляется при снижении ее частоты и, практически, после возникновения му- тация может сохраняться в популяции на протяжении многих десятков и даже сотен поколений. Различные мутации могут случайным образом получить большее распространение в изоли- рованных популяциях или среди групп населения, отличающихся повышенным уровнем инбридинга. В целом, при отсутствии дав- ления отбора по отношению к гетерозиготным особям общая кон- центрация мутантных аллелей в популяции определяется часто- той их спонтанного возникновения, при этом пул мутаций будет состоять из большого количества разнообразных аллелей, каж- дый из которых будет представлен редкими или даже единичными случаями в различных популяциях. Однако, специфические мутации могут получить значи- тельно более широкое распространение в тех случаях, когда гетерозиготные особи имеют какие-либо селективные преиму- щества. Таким эффектом может обладать сама мутация, но более вероятна возможность неравновесности по сцеплению между этой мутацией и селективными аллелями другого локуса. Гетерозиго- ты могут получить преимущество при изменении условий окружа- ющей среды, в каких -то экстремальных ситуациях или среди определенных групп населения. Так например, мутации, повыша- ющие устойчивость организма к действию инфекционных агентов, могут получить широкое распространение в период массовых эпидемий. Одновременно повысится частота всех аллелей других локусов, находящихся в неравновесности по сцеплению с данной мутацией. Мутантные аллели, обеспечивающие селективное преи- мущество гетерозигот, становятся преобладающими во многих популяциях, не полностью изолированных друг от друга. При этом наибольшая частота таких аллелей будет наблюдатся в ра- йонах, где влияние поддерживающего отбора было максимальным (например, в эпицентре эпидемии). По мере удаления от этого района концентрация таких мутантных аллелей будет умень- шаться, причем их распределение в разных популяциях будет коррелировать с характером миграции населения. Подобный ха- рактер распределения определенного мутантного аллеля в частично изолированных популяциях принято связывать с так называемым эффектом основателя или родоначальника. Исследование спектров распределения мутаций в различ- ных популяциях позволяет делать предположения относительно возможного происхождения таких повреждений и тех механизмов, которые лежат в основе их распространения среди населения. Рассмотрим наиболее вероятные интерпретации различных вариантов распределения аллелей в популяциях. Мутации, представленные у единичных больных или в группе родственных индивидуумов и не имеющие специфической внутригенной локали- зации, по-видимому, являются следствием естественного мута- ционного процесса. Если в каких-то популяциях концентрация мутаций в различных генах повышена, вероятно, они находятся в зоне действия внешних неблагоприятных факторов, индуцирую- щих возникновение нарушений в структуре ДНК. В тех случаях, когда локализация и типы мутаций носят специфический харак- тер можно предполагать наличие особых молекулярных механиз- мов контроля повышенного уровня мутагенеза в определеннных районах генома. Распространение специфических мутаций в изо- лированных популяциях происходит за счет их ограниченного размера и повышенного уровня инбридинга (эффект родоначаль- ника). И, наконец, обнаружение градиентного распределения мутаций, превалирующих в различных, частично изолированных популяциях позволяет предполагать селективное преимущество гетерозиготных носителей мутаций на определенных этапах эво- люционного развития. Таким образом, сопоставляя спектры распределения одно- типных мутаций у жителей разных континентов, разных стран, у людей, принадлежащих к различным расам и национальностям можно определить степень генетической близости между всеми этими группами и реконструировать их филогенетические отно- шения (Cavalli-Sforza,Piazza,1993). Одним из практических следствий этих исследований является возможность прогнозиро- вать наиболее вероятные мутации в различных генах у пациен- тов разного этнического происхождения, что приводит к суже- нию спектра поиска специфических мутаций. Особый интерес в этом смысле представляют наиболее распространенные мутации (например delF508 при муковисцидозе; R408W - при фенилкето- нурии и многие другие). Для профилактики наследственных за- болеваний необходима разработка эффективных и простых мето- дов молекулярной диагностики таких мутаций как у больных, так и у гетерозиготных носителей с целью проведения скрини- рующих программ среди населения и выявления максимально воз- можного числа семей с повышенным риском рождения больного ребенка. ГЛАВА VII. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГ- НОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг- ностики. Локализация и клонирование кДНК-овых последовательнос- тей генов открывают принципиально новые возможности диагнос- тики наследственных заболеваний, основанные на исследовании мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предпо- лагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций. Это в равной мере относится и к пренатальной диагностике, которая может быть проведена с использованием молекулярных Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 |
ИНТЕРЕСНОЕ | |||
|