| |||||
МЕНЮ
| Литература - Другое (книга по генетике)¦ ¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦ ¦ ¦точная анемия ¦ ¦ ¦ ¦ ¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦эпителий бронхов¦ ЭР ¦ ¦ ¦дистресс-синдром¦белок В ¦ ¦ ¦ ¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЭР ¦ ¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦ ¦ ¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервные клетки ¦ ЭР ¦ ¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦ ¦ ¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЭР ¦ ¦ ¦Паркинсона ¦ ¦фибробласты ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦ ¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза А ¦стволовые клетки¦ ПВ ¦ ¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крови, ¦ ¦ ¦ ¦дистрофия ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦ ¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервные клетки ¦ ПВ ¦ ¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦ ¦ L--+----------------+-----------------------+----------------+---- - Как следует данных Таблицы 9.2, на стадии клинических испытаний в 1994г. уже находились 5 моногенных заболеваний. Для 10 генных болезней проводились экспериментальные иссле- дования и отрабатывались требования, необходимые для получе- ния официального разрешения клинических испытаний (см.9.1). Исследования по остальным заболеваниям находятся на началь- ных этапах. Список таких заболеваний очень быстро увеличива- ется. Обращает на себя внимание, что первые программы по генной терапии связаны с модификацией гемопоэтических клеток (Wivel, Walters, 1993). Клетки крови наиболее доступны для генетических манипуляций. После изоляции различные типы кле- ток крови могут быть легко размножены, подвергнуты трансфек- ции in vitro, а затем возвращены пациенту. Генетической мо- дификации могут быть подвергнуты не только зрелые клетки (лимфоциты, макрофаги), но и их предшественники - стволовые клетки. Важным обстоятельством, в этой связи, является то, что процедура трансплантации клеток костного мозга уже широ- ко используется в клинике. Разработаны и достаточно эффек- тивные методы выделения стволовых гемопоэтических клеток че- ловека (Berardi etal.,1995). В экспериментах на животных по- казано, что модифицированные клетки как миелоидного, так и лимфоидного рядов могут сохраняться в кровотоке на протяже- нии более двух лет после аутологичной пересадки клеток кост- ного мозга, трансдуцированных in vitro. Путем трансфекции клеток крови соответствующими генами можно лечить не только собственно заболевания крови, но и использовать их для лече- ния многих других заболеваний как моногенной природы (Табл. 9.2), так и различных опухолей и инфекций (см.ниже). Другими достаточно универсальными реципиентами чужерод- ных генов могут быть фибробласты и мышечные клетки (миоблас- ты, миофибриллы). Они могут быть использованы для тех забо- леваний, где необходима коррекция генов, белковые продукты которых должны поступать в сыворотку крови или дифундировать в соседние клетки. Особенно удобны для целей генной терапии скелетные мышцы, в которых благодаря отсутствию эндонуклеаз- ной активности (см.раздел 9.4.2) принципиально возможен пе- ренос генов in vivo путем прямой иньекции экзогенной ДНК. Инъецированная в мышцы ДНК способна экспрессироваться в мио- фибриллах находясь в неинтегрированном, эксрахромосомном состоянии. Белковые продукты экспрессии в течение длительно- го времени после трансдукции будут поступать в кровь. Про- должительность экспрессии значительно увеличивается, если генетическую модификацию производят в аутологичных миоблас- тах, которые после этого инъецируют в зрелую мышцу. Эти осо- бенности уже позволили начать эксперименты по генной терапии таких заболеваний как гемофилии А и В, дефицит антитрипсина, диабет, врожденный дефицит гормона роста и даже болезнь Пар- кинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Достаточно удобны- ми для генетических модификаций оказались и фибробласты ко- жи, в первую очередь, благодаря легкости генноинженерных ма- нипуляций ex vivo. Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний: опухоли, инфекции. Параллельно с развитием исследований в области генокор- рекции наследственных дефектов успешными также оказались по- иски методов терапевтического использования смысловых после- довательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний и, главвным образом, злокачественных опухолей и вирусных ин- фекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии поиски путей генокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число уже одобренных протоколов клинических испытаний во много раз превышает число таковых для лечения моногенных бо- лезней (см.Рис. 9.1). Такое положение дел, по-видимому, прежде всего объясняется широкой распространенностью онколо- гических заболеваний и отсутствием достаточно эффективной терапии. В Табл. 9.3 перечислены основные методологические подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и широко используемые уже на современном этапе. Многие из этих подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьезными инфекционными заболеваниями, например, со спидом. Таблица 9.3. Основные методологические подходы в генокоррек- ции онкологических заболеваний. ---------------------------------T-----------------------------¬ ¦ П Р И Н Ц И П ¦ ВВОДИМЫЕ ГЕНЫ ¦ +--------------------------------+-----------------------------+ ¦1. Повышение иммунореактивности ¦ гены чужеродных ¦ ¦ опухоли ¦ антигенов, цитокинов ¦ ¦2. Генетическая модификация ¦ гены цитокинов, ¦ ¦ иммунных клеток ¦ ко-стимуляторов ¦ ¦3. Инсерция генов "чувствитель- ¦ гены тимидин-киназы HSV, ¦ ¦ ности" либо генов "самоубийц"¦ цитозин дезаминазы ¦ ¦4. Блок экспрессии онкогенов ¦ антисмысловые Ki-ras мРНК, ¦ ¦ ¦ гены внутриклеточных антител¦ ¦5. Инсерция генов-супрессоров ¦ р53 ¦ ¦ опухолей ¦ ¦ ¦6. Защита нормальных клеток от ¦ гены лекарственной ¦ ¦ химеотерапии. ¦ устойчивости тип 1. ¦ ¦7. Индукция синтеза противоопухо¦ гены интерлейкина-2, ¦ ¦ левых в-в нормальными клеткам¦ интерферона ¦ ¦8. Продукция противопухолевых ¦ вакцины типа БЦЖ, экспресси-¦ ¦ рекомбинантных вакцин. ¦ рующей опухолевой антиген ¦ ¦9. Локальная радиопротекция нор-¦ гены трансферазы, ¦ ¦ мальных тканей с помощью ¦ глутатион синтетазы ¦ ¦ антиоксидантов. ¦ ¦ L--------------------------------+------------------------------ Подробный анализ используемых при этом подходов и ре- зультаты первых клинических испытаний выходит за рамки наше- го изложения. Однако, материал этот настолько интересный и многообещающий, что мы позволим себе на нескольких примерах охарактеризовать основные принципы построения таких геноте- рапевтических программ. Как упоминалось ранее (см. 9.1), перенос гена в орга- низм человека был осуществлен в 1989 году в большей степени в исследовательских, а не в терапевтических целях. Это был маркерный прокариотический ген neo, сообщающий клеткам ус- тойчивость к неомицину. Он был введен пациенту, страдающему злокачественной меланомой, в составе трансдуцированных TIL-клеток (Т -лимфоцитов, полученных из опухолевых тканей больного). В 1986г. вскоре после идентификации этого нового класса иммунных клеток, была предпринята попытка лечения ме- ланомы путем аутологичной внутривенной инфузии TIL-клеток, предварительно выделенных из опухолей пациентов и интенсивно наращиваемых in vitro в присутствии ростового фактора IL-2. Примерно у трети пациентов лечение оказалось эффективным, хотя в последующем наблюдали значительное число рецидивов заболевания. Для анализа причин терапевтического эффекта TIL -клеток и совершенствования методики лечения меланомы необ- ходимо было исследовать устойчивость вводимых T-лимфоцитов и их миграцию в организме больного. С этой целью была произве- дена маркировка используемых для лечения TIL-клеток путем их трансдукции в культуре ретровирусным вектором, несущим ген neo, с последующим отбором неомицин-устойчивых клонов и вы- ращиванием их на среде G418. Результаты исследований показа- ли, что реинфузированные G418-устойчивые TIL-клетки действи- тельно проникают в опухоль и могут быть обнаружены там в не- большом количестве даже спустя 9 недель после введения. Най- дены отличия субпопуляции T-лимфоцитов в опухоли от общей популяции инфузированных TIL-клеток. После успешного испытания переноса маркерного гена neo в опухолевые ткани путем аутологичной реинфузии трансфециро- ванных T-лимфоцитов лечение меланомы было дополнена введени- ем в вектор мышиного гена, контролирующего продукцию, так называемого фактора некроза опухоли - TNF. Предолагалось, что локальная секреция этого токсичного для клеток белка в опухолевых тканях будет способствовать формированию иммунно- го ответа. Опасность данной терапевтической процедуры обус- ловлена возможностью разрушения TIL-клеток в печени, мозге и легких. Поэтому экспрессия TNF-гена под гетерологичным про- мотором может оказать сильный токсический эффект в этих ор- ганах. Первые клинические испытания описанной схемы лечения начаты в январе 1991 года в Национальном Институте Здоровья (NIH) США. Другая программа генной терапии, предложенная для лече- ния меланом, основана на стимуляции противоопухолевого имму- нитета, опосредованного T-лимфоцитами. Для этого в изолиро- ванные опухолевые клетки пациента вводят TNF- или IL2-ген или какие-либо другие гены, секретирующие цитокины, и затем проводят иммунизацию пациента путем подкожного введения трансдуцированных клеток. Эта процедура сама по себе может привести к рассасыванию первичной опухоли или может быть ис- пользована для изоляции более эффективных TIL-клеток из лим- фоузлов, вблизи от места инъекции. Подобная иммунизация мо- жет быть рекомендована для предотвращения рецедивов у паци- ентов, подвергавшихся другим курсам противоопухолевой тера- пии. Первая попытка прямого переноса гена в опухолевые клет- ки пациента без их предварительной изоляции также была предпринята с целью формирования иммунного ответа против злокачественной меланомы. Процедура включала прямую иньекцию в опухоль липосом-плазмидного комплекса с геном, контролиру- ющим отсутствующий у пациента антиген гистосовместимости HLA-B7. Другой тип модификации опухолевых клеток основан на введении в них гена тимидинкиназы Герпеса. Использованный в работе ретровирусный вектор обеспечивал включение генной конструкции только в активно пролифирирующие клетки, каковы- ми и являются клетки опухоли. Впервые эта схема была апроби- рована при лечении карциномы яичника. После интраперитоне- альной аутологичной иньекции трансдуцированных клеток злока- чественной карциномы пациентам назначали противогерпесный препарат - ганцикловир, избирательно убивающий клетки, экс- прессирующие ген вирусной тимидин-киназы. Противоопухолевый эффект был обусловлен летальным действием токсина, образую- щегося в модифицированных клетках и последующей иммунной ре- акцией организма на опухолевые клетки. Подходы, используемые для лечения вирусных инфекций пу- тем введения в организм человека специфических нуклеиновых кислот, очень разнообразны и основаны на детальном исследо- вании молекулярных механизмов взаимодействия инфецирующих агентов с клетками-хозяина. Мы лишь коротко перечислим ос- новные принципы, используемые при разработке соответствующих медицинских протоколов. Наибольшее количество противовирус- ных программ генной терапии предложено в рамках борьбы со спидом, хотя аналогичные методы разрабатываются для лечения гепатита, цитомегаловирусных, герпесных и иных вирусных ин- фекций. Одна из первых таких программ была направлена на разрушение регуляторных механизмов репликации вируса иммуно- дефицита - HIV, путем введения в T-лимфоциты от 20 до 50 ко- пий TAR-гена, кодирующего активирующий элемент, критический для переключения генетической программы клетки на вирусную репликацию. Другая программа включала введение в T-лимфоциты гена CD4 вирусного антигена для специфического связывания HIV и выведения его в русло крови. Ряд программ основаны на введении в T-клетки условно летальных генов, таких как ген вирусной тимидинкиназы, с тем, чтобы предотвратить нежела- тельные побочные эффекты в случае неконтролируемого размно- жения этих клеток или слишком сильного их действия на HIV-инфецированные клетки. Одним из направлений повышения эффективности терапевтического использования T-лимфоцитов для лечения спида является направленная модификация ex vivo генов главного комплекса гистосовместимости и конструирова- ние на этой основе "универсальных донорских" клеток. Так, лишенные HLA-маркеров гетерологичные модифицированные T-клетки могут быть трансплантированы пациентам без опасения иммунологической несовместимости. Подобный подход может ока- заться эффективным при необходимости гетерологичной транс- плантации в терапевтических целях любых типов клеток. Прин- ципиально иным способом борьбы с вирусными инфекциями явля- ется введение в пораженные ткани антисмысловых последова- тельностей, способных гибридизоваться с вирусами и, таким образом, их нейтрализовывать (Cohen, Hogan, 1994; Wagner, 1994). Адресность доставки таких последовательностей может быть достигнута путем их комплексирования с соответствующими белковыми лигандами (см. 9.4.2). Раздел 9.7. Некоторые этические и социальные проблемы генной терапии. Появление принципиально новых технологий, позволяющих активно манипулировать с генами и их фрагментами, обеспечи- вающими адресную доставку новых блоков генетической информа- ции в заданные участки генома, совершило революцию в биоло- гии и медицине. Как следует из вышеизложенного, сам ген все чаще начинает выступать в качестве лекарства, применяемого для лечения не только моногенных, но и многих других, в том числе и значительно более распространенных недугов (опухоли, инфекции). Не за горами применение генотерапии и для борьбы с мультифакториальными заболеваниями (сердечно-сосудистые, психические, эндокринологические и многие другие). Уже сей- час, на современном уровне наших знаний о геноме человека теоретически вполне возмножны такие его модификации путем генной трансфекции, которые могут быть предприняты с целью улучшения ряда физических (например, рост), психических и интеллекуальных параметров. Таким образом, современная наука о человека на своем новом витке развития вернулась к идее "улучшения человеческой породы", когда-то постулированной выдающимся английским генетиком Фрэнсисом Гальтоном и разви- той его учениками и последователями (Карл Пирсон, Лионель Пенроуз, Дж.Халдэйн и мн.др.). Дальнейший ход истории, как известно, полностью дискредитировал саму идею "улучшения" человеческой породы. Однако, грядущее "всевластие" человека над собственным геномом заставляет вновь и вновь возвращать- ся к этой теме, делают ее предметом постоянных оживленных дискуссий в широкой и научной печати (Ledley, 1987; Ander- son, 1992; Wivel, Walters, 1993; Culver,1994). Развернувшая- ся в этой связи дискуссия позволяет подвести некоторые итоги и сделать определенные прогнозы. Уже сейчас не вызывает сомнения, что первоначальные опасения, связанные с генной инженерией вообще и генной ин- женерией человека в частности были неоправданны. После мно- голетней дискуссии и всестороннего рассмотрения на разных уровнях было признанным целесообразным применение генной те- рапии для лечения многих заболеваний. Единственным и непре- менным ограничением, сохраняющим свою силу и в современных условиях, является то, что все генотерапевтические мероприя- тия должны быть направлены только на конкретного больного и касаться исключительно его соматических клеток. По глубокому убеждению основных авторитетов генной те- рапии (Фр.Андерсон, Т.Каски, Фр.Коллинс, Дж.Вильсон и мн.др.), а также согласно существующим регламентациям соот- ветствующих "разрешительных" комитетов по генно-инженерным исследованиям (см. 9.1) современный уровень наших знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне по- ловых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей че- ловека. Причина этого - реальная опасность засорения гено- фонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесение мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества. Вместе с тем, по мере совершенствования методов генной терапии, появления новых технологий, связанных с созданием более эффективных и безопасных векторных систем и более со- вершенных генетических конструкций, стремительным ростом объ- ема информации о структуре генома, картировании новых генов в научной литературе все чаще и все настойчивее раздаются при- зывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррек- ции зародышевых и половых клеток человека (Wivel, Walters, 1993; Latchman, 1994). Основным аргументом в пользу таких вмешательств являет- ся тот вполне очевидный факт, что по мере того как все боль- шее число наследственных заболеваний будет доступно эффек- тивной генной терапии, все большее число особей, гомозигот- ных по летальным мутантным генам, будет накапливаться в по- пуляции. Соответственно, тем реальней будут ситуации, когда оба супруга окажутся гомозиготными носителями мутантного ге- на. В этом случае получение здорового потомства потребует генетического вмешательства уже на ранних стадиях и, возмож- но, будет вполне безопасной и реальной трансфекция гамет или ранних зародышей. Эксперименты на животных по созданию искусственных био- логических моделей наследственных болезней (см.Главу VIII ), а также первые клинические испытания по доимплантационной диагностике генных болезней (Verlinsky, Kuliev, 1993; см. Главу VI) убеждают в том, что такой генно-терапевтический подход может быть реальным уже в ближайшем будущем. Вполне естественно, что целесообразность его применения должна оп- ределяться не только генно-инженерными возможностями, но и его социальной значимостью и необходимостью. Вот только не- которые вопросы, которые должны быть решены в рамках предла- гаемой генетиками широкой дискуссии: Сможет ли в будущем генная терапия обеспечить столь полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для потомства? В какой мере полезность и необходимость генотерапевти- ческой процедуры для одной супружеской четы перевесят риск такого вмешательства для всего человечества? Сколь оправданы будут эти процедуры на фоне грядущего перенаселения планеты ? Как будут соотноситься генно-инженерные мероприятия на человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы? Таким образом, генетическая революция апофиозом которой явилась генотерапия не только предлагает реальные пути лече- ния тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых необходимо уже в ближайшем обозри- мом будущем. Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 |
ИНТЕРЕСНОЕ | |||
|