Литература - Другое (книга по генетике)

редко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же

может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутант-

ных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации

могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но

и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в прена-

тальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем

отбора и скрещивания гетерозигот.

Несмотря на огромные методические сложности и высокую

стоимость, направленное получение моделей наследственных бо-

лезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные

представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло-

гические процессы, развивающиеся в организме вследствие на-

рушений работы определенного гена, анализировать влияние

специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарс-

твенные препараты и испытывать различные терапевтические

подходы. Велика также роль генетических линий в разработке

методов генной терапии (см. Главу IX).

ГЛАВА IY.

ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК- ДИАГНОСТИКИ.

Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-

таций.

Каждый генетический локус характеризуется определенным

уровнем изменчивости, то есть присутствием различных аллелей

или вариантов последовательностей ДНК у разных индивидуумов.

Применительно к гену, аллели разделяются на две группы -

нормальные, или аллели дикого типа, при которых функция гена

не нарушена, и мутантные, приводящие к нарушению работы ге-

на. В любых популяциях и для любых генов аллели дикого типа

являются преобладающими. Под мутацией понимают все изменения

в последовательности ДНК, независимо от их локализации и

влияния на жизнеспособность особи. Таким образом, понятие

мутации является более широким по сравнению с понятием му-

тантного аллеля. Уместно, однако, заметить, что в научной

литературе сравнительно часто встречающиеся в популяциях ва-

рианты последовательностей генов, не приводящие к заметным

нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные

мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "му-

тантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.

Как упоминалось ранее, различные изменения в нуклеотид-

ной последовательности транскрибируемых областей ДНК могут

по-разному проявляться в фенотипе. Часть из них не оказывает

никакого влияния на структуру и функцию соответствующего

белка. Примером могут служить замены нуклеотидов, не приво-

дящие к замене аминокислот в силу вырожденности генетическо-

го кода. Мутантные аллели, в свою очередь, могут быть под-

разделены на три класса: (1) мутации, ведущие к полной поте-

ре функции (loss-of-function), (2) мутации, сопровождающиеся

количественными изменениями соответствующих мРНК и первичных

белковых продуктов и (3) доминантно-негативные мутации, из-

меняющие свойства белковых субъединиц таким образом, что они

оказывают повреждающий эффект на жизнеспособность или функ-

ционирование экспрессирующих типов клеток (gain-of-function

мутации). Наибольшим повреждающим действием обладают мута-

ции, приводящие либо к образованию бессмысленного белка, ли-

бо к преждевременному окончанию его синтеза, то есть делеции

или инсерции, не кратные трем нуклеотидам и потому вызываю-

щие сдвиг рамки считывания, а также нонсенс мутации - замены

нуклеотидов, при которых образуются терминирующие стоп-кодо-

ны. Проявление таких мутаций зависит от их внутригенной ло-

кализации. Чем ближе мутации к 5' концу гена, то есть к на-

чалу транскрипции, тем короче их белковые продукты. Такие

абортивные (truncated) белки неспособны к модификациям и

быстро деградируют.

Фенотипическое проявление замен нуклеотидов в кодо-

нах, так нназываемых миссенс мутаций, зависит от природы

соответствующих аминокислотных замен в белке и от функцио-

нальной значимости того домена, в котором это произошло.

Так, замены аминокислот в активных центрах белков могут соп-

ровождаться полной потерей его функциональной активности,

тогда как даже значительно более серьезные нарушения в дру-

гих частях белка часто оказывают существенно меньшее влияние

на фенотип. Мутации на стыке экзонов и интронов (так называ-

емые сплайсинговые мутации) часто нарушают процессинг пер-

вичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо

неправильное вырезание соответствующей интронной области и

трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного

от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, ли-

бо вырезание экзонов и образование делетированного белка. В

обоих случаях сплайсинговые мутации, как правило , обуслав-

ливают тяжелое течение болезни. Нарушения в регуляторных об-

ластях генов сопровождаются количественными изменениями

соответствующего продукта и не затрагивают структуры и функ-

циональной активности белка. Проявление таких мутаций опре-

деляется, в конечном счете, пороговым уровнем концентрации

белка, при котором его функция еще сохраняется. Как правило,

регуляторные мутации менее серьезны и обладают более выра-

женным плейотропным (множественым) эффектом по сравнению с

мутациями структурных генов.

Относительно недавно выявлен новый класс так называемых

динамических мутаций, или мутаций экспансии, связанных с

нестабильностью числа тринуклеотидных повторов в функцио-

нально значимых частях генов. Многие тринуклеотидные повто-

ры, локализованные в транскрибируемых или регуляторных об-

ластях генов, характеризуются высоким уровнем популяционной

изменчивости, в пределах которого не наблюдается фенотипи-

ческих нарушений (Willems,1994). Болезнь развивается лишь

тогда, когда число повторов в этих сайтах превосходит опре-

деленный критический уровень. Наследование таких мутаций,

как правило, отличается от классического Менделевского ти-

па. Для них характерны: различная пенетрантность в сочетании

с неполным доминированием; геномный импринтинг (различия фе-

нотипических проявлений в зависимости от того, получена му-

тация от матери или от отца) и феномен антиципации - на-

растание тяжести проявления заболевания в последующих поко-

лениях (Willems,1994).

Классическим примером мутаций экспансии является синд-

ром ломкой Х-хромосомы (FraXA), обусловленный присутствием

удлиненных CCG повторов в 5'-нетранслируемой регуляторной

области FMR1-гена (Xq27.3). Аналогичные нестабильные повторы

обнаружены еще в трех ломких сайтах, причем два из них

(FraXE и FraXF) расположены на очень небольшом расстоянии

дистальнее FraXA. Во всех четырех случаях CCG-повторы лока-

лизованы вблизи от CpG островков, при этом увеличение числа

копий триплетов выше определенного порогового уровня сопро-

вождается гиперметилированием всей регуляторной GC-богатой

области, вследствие чего и происходит резкое снижение и

полное выключение транскрипционной активности - мутации по

типу " утраты функции" (loss-of-functions). Таким образом,

область CCG-повторов в этих локусах можно рассматривать, как

своеобразный cis-действующий элемент транскрипции (Willems,

1994, Mandel,1994).

Другой тип динамических мутаций описан для 6-ти раз-

личных тяжелых аутосомно-доминантных нейродегенеративных

расстройств (см. Главу X). Для всех этих заболеваний обнару-

жено присутствие удлиненных CAG-повторов в открытой рамке

считывания (ORF). Эти повторы транслируются в протяженные

полиглютаминовые треки, предположительно локализованные в

ДНК- связывающих доменах соответствующих белковых продуктов.

В результате белковые молекулы приобретают новые свойства,

нарушающие нормальные метаболические связи. Таким образом,

нестабильные CAG-повторы можно рассматривать, как

gain-of-function - мутации. Интенсивно обсуждается также

возможность участия амплификации CAG-повторов в формировании

предрасположенности к таким частым расстройствам центральной

нервной системы, как шизофрения и маниакально-депрессивный

психоз. Примером третьей группы болезней экспансии служит

миотоническая дистрофия. При этом заболевании огромные CTG

(или CAG) повторы локализованы в 3'-нетранслируемой области

гена. Они также рассматриваются, как факторы, нарушающие

нуклеосомную организацию гена и подавляющие его транскрипцию

Более подробно болезни экспансии рассмотрены в Главе X.

Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных

заболеваний.

Одним из важных обобщающих итогов молекулярно-генети-

ческих исследований моногенных болезней явилось доказа-

тельство их генетической гетерогенности. Последняя может

быть вызвана разными причинами. Прежде всего, оказалось, что

один и тот же биохимический эффект (фенотип) может быть

обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, мута-

ции одного и того же гена, как установлено, могут приводить

к совершенно разным клиническим проявлениям. Например, мута-

ции гена адренорецептора, сцепленого с Х-хромосомой, могут

быть причиной нейродегенеративного заболевания - болезни

Кеннеди, если они захватывают область тринуклеотидных повто-

ров (Глава X), и в то же время приводить к синдрому тестику-

лярной феминизации, то есть нарушениям половой дифференци-

ровки, если они затрагивают другие последовательности этого

же гена. Крайним выражением такой гетерогенности может слу-

жить пример с геном рецептора тирозинкиназы -RET, различные

мутации которого могут приводить к 4-м совершенно различным

наследственным синдромам, таким как семейная медуллярная

карцинома щитовидной железы, болезнь Гиршпрунга, множествен-

ная эндокринная неоплазия тип 2А (МЭН-2А) и тип 2B (МЭН-2B)

(Hayningen,1994). Подобные фенотипические разнообразия про-

явлений мутаций одного и того же гена получили название ал-

лельных серий. Термин используется уже около 20 лет для

описания групп из нескольких моногенных наследственных забо-

леваний, клинические проявления которых позволяют предпола-

гать их связь с разными генами, в то время как биохимические

и/или генетические исследования доказывают их аллельную при-

роду, то есть в основе их патогенеза лежат разные мутации

одного и того же гена.

В настоящее время известно более 100 таких болезней

(Romeo, McKusick, 1994). Для каждого заболевания из подобной

серии аллелизм мутаций уже доказан на молекулярном уровне.

Причины подобного фенотипического разнообразия могут быть

различными: (1) локализация мутантных аллелей в функциональ-

но разных доменах белка; (2) принципиально разный механизм

действия мутаций (loss-of-function, gain-of-function); (3)

присутствие в том же гене модифицирующего мутантного аллеля

или полиморфизма и (4) влияние генетического окружения на

проявление мутантного аллеля, то есть его взаимодействие с

определенными аллелями гена-модификатора или даже нескольки-

ми такими генами. Углубленный молекулярно-генетический ана-

лиз практически каждого наследственного заболевания указыва-

ет на его значительную генетическую гетерогенность, связан-

ную с различными мутациями гена. Некоторые примеры аллельных

серий и генетической гетерогенности заболеваний будут

рассмотрены более подробно в Главе X.

Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.

Для практических целей и, главным образом, для чтения

научной литературы, важно знать, как записываются мутации.

До недавнего времени единой номенклатуры записи мутаций не

существовало. В 1992 г. двумя американскими учеными Артуром

Боде и Лап-Чи Тсуи была предложена универсальная стандартная

система для обозначения разных мутаций (Beudet, Lap-Сhee

Tsui, 1993). Она рассчитана как на запись аминокислотных за-

мен в белках, так и на нуклеотидные замены и перестановки в

ДНК. В первом случае, каждой аминокислоте соответствует од-

нобуквенный символ (Табл.4.1), слева записывается нормальный

вариант аминокислоты, справа - мутантный, а расположенный в

центре номер соответствует месту замены в цепочке первичного

продукта трансляции. Например, запись D44G означает замену

аспарагина на глицин в 44-м положении полипептидной цепи, а

A655E - аланина на глутамин в пложении 655 белкового продук-

та. Так записываются различные варианты аминокислотных замен

при миссенс мутациях. Буквой Х обозначается место остановки

синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например,

Q39X означает замену глицина на стоп сигнал в 39-м кодоне, а

W1282X - триптофан-триплета на стоп-кодон в положении 1282.

Отсутвие одной или нескольких аминокислот обозначают значком

^-дельта. Так, наиболее частая мутация, приводящая к муко-

висцидозу- ^F508 - означает отсутствие фенилаланина в 508

положении трансмембранного регуляторного белка муковисцидо-

за. Полиморфизмы, связанные с равноценной по функциональной

значимости заменой аминокислот, записывают через черточку.

Например, M/V470 - метионин или валин в положении 470.

Таблица 4.1. Символы аминокмслот.

------------------------T-----------------T--------------¬

¦ Аминокислоты 1¦ 0 Трехбуквенный 1¦ 0

Однобуквенный 1¦

¦ 1¦ 0 символ 1¦ 0 символ 1

¦

+-----------------------+-----------------+--------------+

¦ Аланин 1¦ 0 Ala 1¦ 0 A 1

¦

¦ Аргинин 1¦ 0 Arg 1¦ 0 R 1

¦

¦ Аспарагин 1¦ 0 Asn 1¦ 0 N 1

¦

¦ Аспарагиновая кислота 1¦ 0 Asp 1¦ 0 D 1

¦

¦ Asn и/или Asp 1¦ 0 Asx 1¦ 0 B 1

¦

¦ Цистеин 1¦ 0 Cys 1¦ 0 C 1

¦

¦ Глутамин 1¦ 0 Gln 1¦ 0 Q 1

¦

¦ Глутаминовая кислота 1¦ 0 Glu 1¦ 0 E 1

¦

¦ Gln и/или Glu 1¦ 0 Glx 1¦ 0 Z 1

¦

¦ Глицин 1¦ 0 Gly 1¦ 0 G 1

¦

¦ Гистидин 1¦ 0 His 1¦ 0 H 1

¦

¦ Изолейцин 1¦ 0 Ile 1¦ 0 I 1

¦

¦ Лейцин 1¦ 0 Leu 1¦ 0 L 1

¦

¦ Лизин 1¦ 0 Lys 1¦ 0 K 1

¦

¦ Метионин 1¦ 0 Met 1¦ 0 M 1

¦

¦ Фенилаланин 1¦ 0 Phe 1¦ 0 F 1

¦

¦ Пролин 1¦ 0 Pro 1¦ 0 P 1

¦

¦ Серин 1¦ 0 Ser 1¦ 0 S 1

¦

¦ Треонин 1¦ 0 Thr 1¦ 0 T 1

¦

¦ Триптофан 1¦ 0 Trp 1¦ 0 W 1

¦

¦ Тирозин 1¦ 0 Tyr 1¦ 0 Y 1

¦

¦ Валин 1¦ 0 Val 1¦ 0 V 1

¦

L-----------------------+-----------------+---------------

Принципиальная схема записи и нумерации нуклеотидов

приведена на Рис.4.1. Отсчет нуклеотидов в молекуле ДНК на-

чинается с первого смыслового кодона, так что нуклеотид под

номером +1 соответствует первому нуклеотиду в молекуле кДНК.

Вверх по течению (или справа налево от 3' к 5'-концу) от

первого кодона нуклеотиды записывают со знаком "-", вниз по

течению (от 5 'к 3') - со знаком "+". Для многих генов

отсутствие точных данных о положении инициирующего сайта и

наличие нескольких мест инициации транскрипции существенно

затрудняют нумерацию нуклеотидов. Нуклеотиды экзонов обозна-

чают заглавными буквами, интронов - прописными.

В Табл.4.2. даны примеры обозначения различных мутаций

с использованием как аминокислотной, так и нуклеотидной ну-

мерации. Нуклеотидная система записи особенно важна для

обозначения делеций, инсерций, сплайсинговых мутаций и поли-

морфизмов, не связанных с заменами аминокислот или происхо-

дящими в нетранслируемых частях гена. В случае делеции или

инсерции одного или двух нуклеотидов приводится их буквенное

обозначение. Например, 441delA, 485insTA. При делеции или

инсерции трех и более нуклеотидов указывается только их

число. Так, 852del22 означает делецию 22 нуклеотидов, начи-

ная с 852-го нуклеотида, а 3320ins7 обозначает вставку 7 пар

оснований после нуклеотида 3320. В случае больших вставок

или делеций их размеры указыаются в килобазах, например

2115ins13kb, или обозначаются соответствующие инсертирован-

ные/ делетированные структурные элементы генома. Так,

2115insAlu означает инсерцию Alu-повтора после нуклеотида

2115. При обозначении сплайсинговых мутаций записывают номер

крайнего нуклеотида в ближайшем к мутации экзоне, число нук-

леотидов (со знаком "+" в случае 3' конца экзона и со знаком

"-" в случае 5' конца) и характер нуклеотидной замены.

(Рис.4.1, Таб.4.2). Например, 711+5G-T обозначает замену G

на Т в 5-м основании интрона, следующего за экзоном, закан-

чивающимся 711 нуклеотидом.

Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-

тантных ДНК.

Идентификация мутантных аллелей, то есть обнаружение

нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК,

является самым прямым методом молекулярной диагностики

наследственных заболеваний. Большие перестройки - делеции,

дупликации, инверсии, транслокации - размером более 1 Мb,

затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут

быть обнаружены на цитологических препаратах с использовани-

ем техники высокого разрешения хромосомного анализа (анализ

дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще боль-

шая разрешающая способность (до 50 кb) может быть достигнута

при работе на специальным образом приготовленных (растяну-

тых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибри-

дизации in situ (FISH - Глава II).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35