| |||||
МЕНЮ
| Литература - Другое (книга по генетике)РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра- цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, со- держащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гиб- ридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуп- лексов, которые затем элюируют из геля для последующего ана- лиза (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения направления транскрипции и картирования интронов. Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинети- ческими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек- тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспа- да зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по ди- намике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актино- мицина D, специфическим образом супрессирующего транскрип- цию. Исследование механизмов транскрипции и процессинга пер- вичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием искусственным образом сконструированных транскрипционных систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983; Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три- фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят ради- оактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК прово- дят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее описанных методов анализа мРНК, используют немеченые кДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим достоинством этой транскрипционной системы является ее максимальная приближенность к естественным процессам. При втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагмен- тов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и регуляторных белков. Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе- мы. Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттрансляционных модификаций белков основаны на использо- вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати- ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер- жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино- кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав- ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова- ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами, при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако, для значительного числа моногенных наследственных заболева- ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова- тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими- ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от- носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными структурами клеток. ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу- ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством анализа структуры, функции и синтеза белков (Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно- ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь- ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива- ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин- женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч- но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы, в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге- нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках. Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль- ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и их используют, обычно, для производства большого количества чистого белка, необходимого для получения антител или для фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе- ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь- ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му- тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи- мости различных участков белка. Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет- ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти- ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее использовать для изучения посттрансляционных модификаций белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп- тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо- ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую- щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить его в кристаллической форме и исследовать пространственную структуру и функциональное назначение отдельных доменов (Хэймс, Хиггинс, 1987). Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко- дирующих последовательностей гена рассматривалось ранее (см. Глава II). После секвенирования кДНК можно, исходя из гене- тического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных последовательностей в составе белков с уже известной струк- турой и функциями. Выявление родственных белков, близких по своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег чает дальнейший молекулярный анализ функционирования иссле- дуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность белка позволяет прогнозировать его третичную структуру, идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным практическим следствием этих данных является также возмож- ность получения антител к строго специфичным участкам бел- ка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохими- ческий и молекулярно-генетический. В первом случае для имму- низации используют искусственно синтезированные полипептиды, которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену). Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 амино- кислот - они не могут быть очень большими из-за высокой сто- имости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В резуль- тате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в котором наряду с аминокислотной последовательностью селекти- руемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемо- го белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации животных и получения моновалентных или моноклональных анти- тел. При наличии антител могут быть применены различные им- мунологические подхооды для анализа тканеспецифического и внутриклеточного распределения белка, исследования его моди- фикаций, а также для получения нативного белка в препаратив- ных количествах. Cледующим шагом на пути анализа молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена является идентификация тех наруше- ний в структуре, локализации и активности молекул мРНК и белка, которые возникают вследствие генетических мутаций. Мы уже упоминали об огромном значении культур мутантных клеток для подобных исследований. Однако, многие патологические процессы, протекающие в организме больного, не могут быть исследованы in vitro. С другой стороны, возможности получе- ния необходимого количества клеток и тканей пациента и испы- тания in vivo различных схем лечения значительно ограничены. Поэтому для многих наследственных болезней эффективность изучения основ патогенеза существенным образом зависит от наличия адекватных биологических моделей. Способы конструи- рования таких моделей подробно изложены в Главе YIII. ГЛАВА II. ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ. Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен- тов. Термин геном используется для обозначения полной гене- тической системы клетки, определяющей характер онтогенети- ческого развития организма и наследственную передачу в ряду поколений всех его структурных и функциональных признаков. Понятие генома может быть применено к таксономической груп- пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви- русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про- кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из- менениями, происходящими в геноме специфических клеток в процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном определяется как генетическая информация, заключенная в мо- лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид- ный геном и таксономическим статусом видов, а также много- численные примеры существования огромных различий в содержа- нии ДНК между близкородственными видами (так называемый "С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия ге- нома и ДНК в значительной степени тождественны, так как основные принципы организации и функционирования генома це- ликом определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам потенциальные возможности практически неограниченного струк- турного разнообразия определяют все многообразие мира живых существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных раз- личий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985). Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как правило, сопровождался накоплением изменений в структуре ге- нома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как ло- кализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК, приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функ- ции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь- ностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариа- бильность и филогенетический консерватизм первичной структу- ры генома. В пределах одного вида основные параметры генома достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечи- вается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения, вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются не- экспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов, межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.). Геномы эукариот, по-существу, можно рассматривать как мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из обли- гатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу облигатных элементов составляют структурные локусы, коли- чество и расположение которых в геноме достаточно постоянно. Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК, амплифицированных участков, ретровирусных последователь- ностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, рет- ротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и раз- личных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) явля- ется не строго обязательным, их количество и положение может значительно варьировать, то есть эти элементы являются фа- культативными. В то же время участие факультативных элемен- тов в наследственной передаче признаков, в формировании му- тационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях ви- дов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный переход от одних состояний к другим за счет инсерции экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозо- ноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно, несмотря на значительные отличия факультативных последова- тельностей от облигатных по характеру основных информацион- ных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегре- гации), они также должны рассматриваться, как важнейшие эле- менты генома. Остановимся теперь более детально на основных принципах организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46 хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим независимым оценкам истиное число структурных генов нахо- дится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложе- ны современные подходы, используемые для подсчета общего ко- личества генов, из которых следует, что наиболее вероятная оценка их числа составляет около 80 000. Сопоставляя это значение со средними размерами гена и соотношением между ве- личиной их экзонных и интронных областей, можно заклю- чить,что кодирующие последовательности ДНК занимают не более 10-15% всего генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким образом, основная часть молекул ДНК не несет информации об амино- кислотной последовательности белков, составляющих основу лю- бого живого организма, и не кодирует структуру рибосомаль- ных, транспортных, ядерных и других типов РНК. Функции этой "избыточной" (junk) ДНК не ясны, хотя ее структура изучена достаточно подробно. Предполагается, что эта ДНК может участвовать в регуляции экспрессии генов и в процессинге РНК, выполнять структурные функции, повышать точность гомо- логичного спаривания и рекомбинации, способствовать успешной репликации ДНК и, возможно, является носителем принципиально иного генетического кода с неизвестной функцией. Наиболее общая характеристика генома может быть получена с помощью анализа кинетики реассоциации молекул ДНК. Динами- ка плавления геномной ДНК обнаруживает присутствие по край- ней мере трех различающихся по химической сложности фракций (Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Быстро ренатурирую- щая фракция ДНК состоит из относительно коротких высокопов- торяющихся последовательностей; в промежуточную фракцию вхо- дит множество умеренно повторяющихся ДНК - более протяжен- ных, но представленных меньшим числом копий; медленно рена- турирующая фракция объединяет в себе уникальные последова- тельности ДНК, встречающиеся в геноме не более 1-2 раз. С помощью молекулярного анализа проведена идентификация основных классов повторяющихся последовательностей ДНК, составляющих более 35% всего генома человека и включающих сателлитную ДНК, инвертированные повторы, умеренные и низко- копийные повторы, а также мини- и микросателлитные последо- вательности ДНК. Классификация этих типов повторов достаточ- но условна и основана, главным образом, на двух характе- ристиках: длине повторяющихся коровых единиц, которая может варьировать от 1-2 до более, чем 2000 п.о., и числе их ко- пий, также меняющихся в очень широких пределах - от десятка до миллиона на гаплоидный геном. Не менее важными характе- ристиками различных классов повторяющихся ДНК являются нук- леотидная последовательность "коровых" единиц повтора, спе- цифичность их организации, хромосомная локализация, внутри- и межвидовая стабильность, а также возможные функции этих типов ДНК. Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности ДНК. Сателлитная ДНК это класс высокоповторяющихся последо- вательностей, составляющих около 10% всего генома человека (Kao, 1985). При центрифугировании геномной ДНК в градиенте плотности CsCl эти последовательности образуют четыре от- дельных сателлитных пика с различными средними значениями плавучей плотности. Методом гибридизации in situ показано присутствие сателлитной ДНК преимущественно в центромерных, теломерных и гетерохроматиновых районах большинства хро- мосом, при этом характер гибридизации сходен для всех четы- рех групп и не зависит от принадлежности ДНК-зондов к се- мействам повторов, образующих различные сателлитные пики. В каждой из этих групп, однако, присутствует небольшое коли- чество последовательностей, имеющих специфическую хромосом- ную локализацию. Так например, около 40% длинного плеча Y хромосомы составляет семейство последовательностей, тандемно Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 |
ИНТЕРЕСНОЕ | |||
|